三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方抗動脈粥樣硬化作用及機制研究.pdf

1、研究背景
　　動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是多種心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，是發(fā)達(dá)國家人群的主要死亡原因之一，在我國，尤其是近年來，AS的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。因而，對于AS發(fā)病機制及治療藥物的研究尤顯重要，但動脈粥樣硬化的致病因素和發(fā)病機制極其復(fù)雜，且迄今為止，仍未有確切的學(xué)說證明其機制。19世紀(jì)80年代以來，關(guān)于AS發(fā)病機制學(xué)說眾多，主要包括脂質(zhì)浸潤、內(nèi)皮損傷、平滑肌細(xì)胞

2、異常增殖等等。而隨著研究的逐漸深入，炎癥損傷和氧化應(yīng)激逐漸成為人們公認(rèn)的較為重要的發(fā)病機制，也是眾多學(xué)者們研究的重點。
　　關(guān)于治療動脈粥樣硬化的藥物，目前應(yīng)用最廣泛的為他汀類藥物，其對于血脂的調(diào)節(jié)效果顯著，尤其是在降低LDL方面，且有研究表明，他汀類藥物除能夠有效降低血脂外，還具有抗炎、抗氧化、修復(fù)血管和抑制血小板聚集等作用。但隨著臨床應(yīng)用的深入，研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物具有肝毒性、肌肉損傷、胃腸道反應(yīng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等不良反應(yīng)。而中

3、藥復(fù)方作為一種多成分、多靶點的傳統(tǒng)藥物，能夠有效減少機體服藥后的不良反應(yīng)，降低藥物耐藥性發(fā)生率，且與動脈粥樣硬化發(fā)病機制的多樣性相吻合，在治療AS上，具有一定優(yōu)勢。從中醫(yī)角度來講，動脈粥樣硬化病因為氣血陰陽不足，痰瘀熱毒互結(jié)，阻滯脈絡(luò)，臨床上的治療手段多以活血化瘀，化痰解毒為主。三黃瀉心湯是臨床經(jīng)典小復(fù)方，始載于《金匱要略》，由大黃，黃連和黃芩組成，主要作用為清熱解毒，活血化瘀。課題組在前期對于三黃瀉心湯炮制配伍九種組分的藥效學(xué)作用篩選

4、實驗中發(fā)現(xiàn)，組方7對于血瘀大鼠具有良好的治療作用，故而本實驗以三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方（組方7）為受試藥物，研究其對AS的治療作用及其作用機制。
　　研究內(nèi)容
　　1.三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方對大鼠動脈粥樣硬化的作用
　　采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合維生素D3注射及免疫反應(yīng)激發(fā)的方法復(fù)制大鼠動脈粥樣硬化模型，分為對照、模型、陽性藥及三黃瀉心湯大、中、小劑量6組。造模8周，給藥4周。于12周末，腹主動脈取血，測定以下指標(biāo):總膽固

5、醇(TotalCholesterol，T-CHO)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇（High-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、一氧化氮(Ni

6、tric oxide，NO)、超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素6（int erl eukin-6，IL-6）、白介素8(interleukin-8，IL-8)、白介素18(interleukin-18,IL-18)、6-酮-前列腺

7、素1α（6-keto-prostaglandin F1α,6-keto-PGF1α）、內(nèi)皮素(Endothelin，ET)、血栓烷素B2(Thromboxane B2,TXB2)。同時固定其主動脈，HE染色，顯微鏡下觀察血管的病理變化情況。
　　2.三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方對HUVECs的保護(hù)作用
　　體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umilical vein endothelial cell, HUVECs)，MTT

8、法測定三黃瀉心湯最大無毒濃度，以200μg·mL-1Ox-LDL建立細(xì)胞損傷模型[]，測定細(xì)胞存活率;采用放免法測定ET、6-keto-PGF1α、TXB2，分光光度法測定MDA、SOD、NO，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定細(xì)胞上清液中細(xì)胞間粘附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、人血管細(xì)胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCA

9、M-1）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocytechemotactic protein1，MCP-1)的含量。以60 ng·mL-1 TNF-α造模，測定細(xì)胞存活率，ELISA檢測細(xì)胞上清液中的ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、IL-1β、IL-6、IL-8水平，分光光度法測定NO的含量。
　　3.三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方抗AS作用機制的研究
　　體外培養(yǎng)HUVECs，以200μg·mL-1 Ox-LDL建立細(xì)胞氧化應(yīng)

10、激損傷模型，ELISA法測定細(xì)胞上清液ROS含量，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率及線粒體膜電位變化，Western Blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)情況。以60 ng·mL-1 TNF-α造成細(xì)胞炎癥損傷模型，Western Blot法檢測炎癥相關(guān)蛋白VE-Cadherin、E-Selectin、ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)水平。
　　實驗結(jié)果
　　1.三黃瀉心湯活血化

11、瘀優(yōu)勢方對大鼠動脈粥樣硬化的作用
　　1)對血脂水平的影響:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方能夠有效降低TC、TG、LDL-C水平、升高HDL-C水平。
　　2)對抗氧化作用的影響:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方對于升高SOD活性，降低MDA活性具有一定的作用。
　　3)對抗炎作用的影響:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方能夠降低Hs-CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18等促炎因子的含量。
　　4)對內(nèi)皮功能的

12、影響:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方對于升高NO、6-keto-PGF1α含量和降低ET、TXB2含量具有顯著作用。
　　5)對血管病理形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方能夠減少脂質(zhì)沉積及膽固醇結(jié)晶，改善鈣化程度。
　　2.三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方對HUVECs的保護(hù)作用
　　1)藥物最大無毒濃度及給藥量:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方的最大無毒濃度為62.5μg·mL-1。選取62.5、31.25、15.625μg·mL-

13、1三個濃度作為細(xì)胞給藥濃度。
　　2)對細(xì)胞存活率的影響:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方能夠明顯提高由Ox-LDL和TNF-α誘導(dǎo)損傷的HUVECs的存活率。
　　3)對細(xì)胞分泌活性物質(zhì)含量的影響:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方能夠顯著降低由Ox-LDL誘導(dǎo)損傷的HUVECs中MDA、ET、TXB2、 ICAM-1、VCAM-1、MCP-1含量，升高SOD、NO、6-keto-PGF1α含量。并且明顯降低由TNF-α誘導(dǎo)損傷的HUVEC

14、s中ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、IL-1β、IL-6、IL-8的含量，升高NO含量。
　　3.三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方抗AS作用機制的研究
　　1)抗氧化應(yīng)激引起的凋亡:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方能夠減少ROS的分泌，降低細(xì)胞凋亡率，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)（減少Bax、caspase-3、caspase-9表達(dá)量并增加Bcl-2的表達(dá)量）。
　　2)抗炎作用:三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方可有效降低炎癥相關(guān)蛋白(VE

15、-Cadherin，E-Selectin、ICAM-1、VCAM-1)的表達(dá)量。
　　結(jié)論
　　1.三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方可從調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、抗炎、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能等多方面發(fā)揮保護(hù)AS大鼠的作用。
　　2.三黃瀉心湯活血化瘀優(yōu)勢方能夠有效保護(hù)由Ox-LDL和TNF-α誘導(dǎo)損傷的HUVECs，并且該組方可減少炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)從而抑制炎癥發(fā)展，亦可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)從而抑制由氧化應(yīng)激引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其保