家蠅MdDpt和MdAtt-2基因的克隆與表達.pdf

1、抗菌肽是一類具有抗菌活性的小分子多肽，是生物體免疫系統(tǒng)的重要組分。家蠅（Musca domestica）生活在細菌橫生的惡劣環(huán)境中，表現(xiàn)出很強的適應能力，這是因為其自身具有較為完善的免疫系統(tǒng)，形成了抵御外來有害微生物入侵的防御機制。
　　 本論文以家蠅為研究材料，研究內(nèi)容主要分為3個部分：
　　 第1部分：通過RT-PCR及RACE技術從家蠅幼蟲體內(nèi)克隆獲得2 種不同的抗菌肽基因的cDNA序列，根據(jù)同源分析，將其分別命名

2、為：家蠅雙翅肽（Musca domesticaDiptericin，MdDpt）和家蠅攻擊素-2（Musca domestica Attacin-2，MdAtt-2），并對其蛋白質(zhì)序列進行了分析；
　　 第2 部分：以家蠅β-actin基因作為內(nèi)參分子，利用半定量RT-PCR對經(jīng)大腸桿菌（Escherichia coli）刺激后MdDpt和MdAtt-2基因的mRNA表達水平進行相對定量研究；
　　 第3 部分：構建了家

3、蠅MdDpt和MdAtt-2基因的原核表達載體，并在大腸桿菌DE3體內(nèi)進行誘導表達，以純化后的DsbA-MdDpt融合蛋白免疫新西蘭大白兔制備了抗血清。
　　 研究結果：
　　 （1）得到一條全長410bp的家蠅MdDpt基因cDNA序列，包含一個300bp的完整開放閱讀框（ORF），根據(jù)ORF推導的MdDpt 多肽由99個氨基酸殘基組成，SignalP3.0 程序預測n端包括20個氨基酸殘基的信號肽，MdDpt成熟肽由

4、79個氨基酸殘基組成，理論分子量為8.79kD，理論等電點為8.27。同源性分析表明，它與廄蠅（Stomoxyscalcitrans）的Diptericin A mRNA相似性最高（identity=74％）。
　　 （2）MdAtt-2基因cDNA 序列其全長809bp，編碼區(qū)長726bp，根據(jù)ORF推導的MdAtt-2多肽由241個氨基酸殘基組成，SignalP 3.0程序預測N 端包括22個氨基酸殘基的信號肽，MdAtt-

5、2成熟肽由219個氨基酸殘基組成，理論分子量為23.63kD，理論等電點為9.77。同源性分析表明，氨基酸與棕尾別麻蠅（Sarcophaga peregrina）的Sarcotoxin IIA 具有最高相似性（identity=45％）。
　　 （3）半定量RT-PCR分析：數(shù)據(jù)分析表明在未經(jīng)誘導的家蠅幼蟲體內(nèi)2個基因的表達量均很低，經(jīng)過大腸桿菌（E. Coli）刺激后2個基因表達量迅速上調(diào)，在12h后達到高峰，隨后逐漸恢復，7

6、2h后趨于恢復向正常水平，通過t 檢驗，2個基因的表達量在6~72h后均高于未刺激的對照組，且具有顯著性差異（P<0.01）。
　　 （4）利用高效原核表達載體pET-DsbA，成功實現(xiàn)了MdDpt和MdAtt-2基因在大腸桿菌DE3中的融合表達，IPTG終濃度為0.8mmol/L。SDS-PAGE蛋白電泳顯示，獲得的融合蛋白DsbA-MdDpt分子量約為33kD，融合蛋白DsbA-MdAtt-2分子量約為48kD，目的條帶大小