人E2F3基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、分類(lèi)號(hào)——密級(jí)單位代碼學(xué) 號(hào)西北大學(xué)碩士學(xué)位論文1 0 6 9 72 0 0 2 2 3 9 9題目 厶里呈里! 塞囤煎盤(pán)隆當(dāng)盤(pán)i 逝塞作者盎逮指導(dǎo)教師鎣生態(tài) 專業(yè)技術(shù)職務(wù) 到塾握學(xué)科( 專業(yè)) 塑塹生答辯日期——學(xué)位授予日期——二0 0 五年五月人E 2 F 3 基因的克隆與表達(dá)研究摘要目的：E 2 F 轉(zhuǎn)錄因子是細(xì)胞周期中G 1 期進(jìn)入S 期的重要調(diào)控因子。同時(shí)，E 2 F 因子與腫瘤的發(fā)生和細(xì)胞凋亡有著緊密的關(guān)系。為了研究人E 2

2、 F 3 ( E 2 F 家族成員) 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能，了解其與腫瘤發(fā)生的聯(lián)系，從人組織中克隆E 2 F 3 基因，構(gòu)建其原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)其原核表達(dá)和真核表達(dá)，從而為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。方法：通過(guò)T d z o l 法抽提人肝癌細(xì)胞的總R N A ，然后逆轉(zhuǎn)錄制備e D N A 。以e D N A 為模板通過(guò)巢式P C R 和橋聯(lián)P C R 的方法克隆E 2 F 3 基因，構(gòu)建了四種E 2 F 3 基因的原核表達(dá)載

3、體p E T 2 8 a - E 2 F 3 、p E T 3 2 a ．E 2 F 3 、p Q E 3 0 - E 2 F 3 和p G E X ．4 T - E 2 F 3 和一種真核表達(dá)載體p E G F P - N 1 ．E 2 F 3 。原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化B L 2 1工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)，用W e s t e r n b l o t 檢測(cè)重組蛋白。真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染T 2 4 細(xì)胞觀察克隆的E 2 F 3 基因在真核細(xì)胞中有無(wú)表達(dá)活

4、性。結(jié)果：成功克隆出E 2 F 3 全長(zhǎng)基因，通過(guò)更換不同的表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)了對(duì)E 2 F 3基因的原核表達(dá)并且對(duì)表達(dá)的重組蛋白用W e s t e r n 方法進(jìn)行了檢測(cè)。另外還構(gòu)建了E 2 F 3 基因的真核表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染T 2 4 細(xì)胞表明構(gòu)建的E 2 f 3 真核表達(dá)載體具有表達(dá)活性，這為以后的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)做好了前期的準(zhǔn)各。結(jié)論：E 2 F 3 基因近5 ’端一段富含G C 的序列會(huì)嚴(yán)重影響E 2 F 3 基因的P C R擴(kuò)增，我

5、們推測(cè)這段序列可能是E 2 F 3 基因的一個(gè)內(nèi)部調(diào)控區(qū)，它可能會(huì)通過(guò)形成二級(jí)發(fā)夾結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)控E 2 F 3 基因的表達(dá)。另外發(fā)現(xiàn)E 2 F 3 基因在不同的原核表達(dá)載體中存在表達(dá)差異，融合有G S T 的E 2 F 3 基因較易實(shí)現(xiàn)原核表達(dá)，這可能是因?yàn)楸磉_(dá)載體功能元件的差異和E 2 F 3 基因本身的一些特點(diǎn)所致。關(guān)鍵詞：E 2 F 3 ；T r i z o l ；P C R ；克隆；表達(dá)； W e s t e r n b l o t