人E2F3基因的克隆與表達研究.pdf

1、分類號——密級單位代碼學 號西北大學碩士學位論文1 0 6 9 72 0 0 2 2 3 9 9題目 厶里呈里! 塞囤煎盤隆當盤i 逝塞作者盎逮指導教師鎣生態(tài) 專業(yè)技術職務 到塾握學科( 專業(yè)) 塑塹生答辯日期——學位授予日期——二0 0 五年五月人E 2 F 3 基因的克隆與表達研究摘要目的：E 2 F 轉(zhuǎn)錄因子是細胞周期中G 1 期進入S 期的重要調(diào)控因子。同時，E 2 F 因子與腫瘤的發(fā)生和細胞凋亡有著緊密的關系。為了研究人E 2

2、 F 3 ( E 2 F 家族成員) 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構和功能，了解其與腫瘤發(fā)生的聯(lián)系，從人組織中克隆E 2 F 3 基因，構建其原核表達載體和真核表達載體，實現(xiàn)其原核表達和真核表達，從而為進一步的研究奠定基礎。方法：通過T d z o l 法抽提人肝癌細胞的總R N A ，然后逆轉(zhuǎn)錄制備e D N A 。以e D N A 為模板通過巢式P C R 和橋聯(lián)P C R 的方法克隆E 2 F 3 基因，構建了四種E 2 F 3 基因的原核表達載

3、體p E T 2 8 a - E 2 F 3 、p E T 3 2 a ．E 2 F 3 、p Q E 3 0 - E 2 F 3 和p G E X ．4 T - E 2 F 3 和一種真核表達載體p E G F P - N 1 ．E 2 F 3 。原核表達載體轉(zhuǎn)化B L 2 1工程菌進行誘導，用W e s t e r n b l o t 檢測重組蛋白。真核表達載體轉(zhuǎn)染T 2 4 細胞觀察克隆的E 2 F 3 基因在真核細胞中有無表達活

4、性。結(jié)果：成功克隆出E 2 F 3 全長基因，通過更換不同的表達載體實現(xiàn)了對E 2 F 3基因的原核表達并且對表達的重組蛋白用W e s t e r n 方法進行了檢測。另外還構建了E 2 F 3 基因的真核表達載體，通過轉(zhuǎn)染T 2 4 細胞表明構建的E 2 f 3 真核表達載體具有表達活性，這為以后的細胞學實驗做好了前期的準各。結(jié)論：E 2 F 3 基因近5 ’端一段富含G C 的序列會嚴重影響E 2 F 3 基因的P C R擴增，我

5、們推測這段序列可能是E 2 F 3 基因的一個內(nèi)部調(diào)控區(qū)，它可能會通過形成二級發(fā)夾結(jié)構來調(diào)控E 2 F 3 基因的表達。另外發(fā)現(xiàn)E 2 F 3 基因在不同的原核表達載體中存在表達差異，融合有G S T 的E 2 F 3 基因較易實現(xiàn)原核表達，這可能是因為表達載體功能元件的差異和E 2 F 3 基因本身的一些特點所致。關鍵詞：E 2 F 3 ；T r i z o l ；P C R ；克??；表達； W e s t e r n b l o t