脂質運載蛋白2基因lcn-,2-在大鼠肝再生中作用研究.pdf

1、脂質運載蛋白2基因lcn2編碼的小分子分泌型蛋白是脂質運載蛋白家族的成員之一,在細胞增殖、分化和凋亡等多種生理過程中起調節(jié)作用。為探討lcn2過量或降低表達對肝臟再生的作用,本文以大鼠再生肝為材料,參照lcn2的mRNA序列信息設計克隆引物和帶酶切位點引物,采用分子克隆技術得到lcn2的克隆載體,測序證實正確后，以其為模板，進一步將基因克隆到真核表達載體pEGFP-N1上，構建出表達載體pEGFP-N1-lcn2；另外，同樣參照lcn2

2、的mRNA序列信息，利用銳博、Genesil、Ambion和QIAGEN等網(wǎng)站的在線設計工具，查閱siRNA設計相關論文，針對lcn2mRNA的2個區(qū)域合成寡聚核苷酸片段連接到干涉載體pGenesil-1.0上,構建出2個干涉lcn2mRNA的干涉載體pGenesil-1.0-l292和pGenesil-1.0-l616；酶切上述的表達載體pEGFP-N1-lcn2得到lcn2的ORF,將其連接到干涉載體pGenesil-1.0-l29

3、2和pGenesil-1.0-l616上,構建出干涉載體對應的檢驗載體pGenesil-1.0-l292-lcn2和pGenesil-l.0-l616-lcn2。用尾靜脈液壓轉基因法,分別將構建的表達載體pEGFP-N1-lcn2、干涉載體pGenesil-1.0-1292和pGenesil-1.0-1616及檢驗載體pGenesil-1.0-l292-lcn2和pGenesil-1.0-l616-lcn2注入大鼠體內,用熒光顯微技術觀

4、察肝組織的陽性細胞(數(shù)),并檢測轉lcn2后大鼠死亡率、肝指數(shù)、肝再生率和組織形態(tài)結構的變化。電泳和測序檢測表明，本論文構建的lcn2的表達載體、干涉載體和檢驗載體正確，有生物學作用。熒光顯微檢測表明，pEGFP-N1-lcn2、pGenesil-1.0-l292和pGenesil-1.0-l616載體的綠色熒光蛋白基因的表達高峰為12h，pGenesil-1.0-l292-lcn2和pGenesil-1.0-l616-lcn2載體的綠

5、色熒光蛋白基因的表達高峰為6h。并且與對照載體pGenesil-1.0-hk-lcn2相比，檢驗載體pGenesil-1.0-l292-lcn2和pGenesil-1.0-l616-lcn2的綠色熒光蛋白陽性細胞率比對照低5％左右，初步說明設計合成的兩個干涉片段均有一定干涉作用。肝指數(shù)檢測表明，在轉基因后120和168h,轉pEGFP-N1-lcn2載體組肝指數(shù)比對照和PH組??；在轉基因后72、120和168h,轉pGenesil-1.