大鼠肝再生中Fcgr2a啟動子區(qū)甲基化變化和作用研究.pdf

1、肝臟是人和動物體內負責代謝的樞紐器官，具有強大的再生能力[1]，其具體調控機制是再生醫(yī)學領域研究的熱點。在正常條件下，絕大多數肝細胞處于靜息狀態(tài)，然而當肝臟受到創(chuàng)傷、切除、壞死等肝損傷刺激后，會引發(fā)一系列病理生理過程，這種現象被稱為肝再生(liver regeneration，LR)。該過程是由肝臟各種細胞和各種肝外器官協(xié)同配合完成的，涉及到復雜的分子機制。肝再生過程為活體肝移植（living donor liver transplan

2、tation，LDLT）和術后修復提供了重要的研究思路。
　　DNA甲基化是一種廣泛存在于真核生物和原核生物中的表觀遺傳現象，本篇我們主要研究真核生物體內的DNA甲基化現象。在真核生物體內，S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將甲基基團轉移到胞嘧啶上，這個胞嘧啶一般位于CpG雙核苷酸上，這一過程是由DNA甲基轉移酶催化完成的。在啟動子區(qū)域和基因調節(jié)區(qū)域，CpG島的甲基化程度降低，其基因的表達通常會升高，反之，GpG島的甲基化程度升高，其

3、基因的表達多表現為降低。另外這兩個區(qū)域的甲基化程度對于細胞分化也起著重要的作用[2,3]。
　　應用第二代測序技術(Next Generation Sequencing，NGS)對清晰闡述基因組中甲基化的分布模式，深入了解生物發(fā)育及其發(fā)病機制具有及其重要的意義，這是僅僅靠小范圍測量CpG位點遠遠不能達到的。因此我們使用了甲基化基因的免疫共沉淀測序(Methylated DNA Immunoprecipitation Sequenc

4、ing，MeDIP-seq)技術檢測肝再生早期0h、2h、6h甲基化信號源的分布，發(fā)現其廣泛分布于每一條染色體上。且有76％-80％的讀長序列(reads)可以比對上參考基因組。進一步分析基因組水平的甲基化基因的種類和數量，發(fā)現在大鼠肝再生的2h和6h，5207個基因的甲基化水平高于或低于對照2倍，稱為有意義甲基化變化基因，與相應對照組比較后，得到了114個肝再生相關的甲基化基因(FDR≤0.05)。其中，在2h差異的有90個基因，6h

5、差異的有71個基因。使用GO和IPA軟件分析上述114個肝再生相關的甲基化基因，發(fā)現有18個甲基化基因參與了40條肝再生相關的信號通路，52個甲基化基因參與37種生理活動。為了檢驗上述篩選方法是否正確，分析是否有效，我們采取了亞硫酸氫鹽測序(Bisulfite Sequencing PCR，BSP)方法對肝再生相關甲基化基因Fcgr2a的啟動子區(qū)域做進一步實驗驗證。結果表明，擴增片段共包括24個CpG位點，其中有15個(CpG5-CpG

6、19)位子CpG島上。重點分析CpG島發(fā)現，PH2h的甲基化程度顯著高于對照，其中CpG位點9、12、13、16、17差異極顯著。與此同時，我們利用qRT-PCR技術檢測其mRNA在肝再生中的表達動態(tài)，利用Western Blot技術檢測其蛋白表達動態(tài)。結果表明，mRNA在PH2h-12h和PH36h的表達量顯著低于對照。其蛋白表達量也于PH2h開始逐漸下降，并在PH6h達到最低，這與mRNA的表達趨勢一致。這種變化可能與該基因啟動子區(qū)