胰腺炎相關蛋白基因(pap)對大鼠肝再生的作用研究.pdf

1、胰腺炎相關蛋白(PAP)，是從胰腺炎患者的胰液中發(fā)現(xiàn)的一種炎癥蛋白，有促進有絲分裂、抗細胞凋亡、抗炎癥和促進細胞與胞外基質粘附等作用。為揭示其在肝再生中的作用，本文根據(jù)大鼠pap基因的mRNA序列，采用分子克隆的方法克隆出Pap基因。在此基礎上設計干涉片段并構建出Pap基因的兩個干涉載體pGenesil-1.0-pap(289)和pGenesil-1.0-pap(485)，三個檢驗載體pGenesil-1.0-pap(289)-pap、

2、pGenesil-1.0-pap(485)-Pap和pGenesil-1.0-HK-pap，并通過尾靜脈液壓轉基因方法檢測各檢驗載體的作用，篩選出最佳干涉載體pGenesil-1.0-pap(485)。采用脂質體轉染法將pEGFP-N1-pap及對照pEGFP-N1，pGenesil-1.0-pap(485)及對照pGenesil-1.0-HK等4種質粒轉入肝癌細胞BEL-7402內(nèi)，再用G418篩選出穩(wěn)定轉染細胞株，并進行以下檢測：采

3、用活體觀察和HE染色觀察細胞形態(tài)結構；細胞計數(shù)和MTT法測定細胞的生長曲線；PCNA細胞免疫化學檢測細胞增殖；Hoechst33258染色檢測細胞凋亡；甲基纖維素半固體培養(yǎng)基檢測集落形成率；藥物MTT法檢測細胞的耐藥性。為進一步研究pap對肝再生的作用奠定基礎，也為揭示肝再生的分子機制提供信息。體內(nèi)實驗采用液壓轉基因技術將pEGFP-N1-pap及對照pEGFP-N1、pGenesil-1.0-pap(289)和pGenesil-1.0

4、-pap(485)及對照pGenesil-1.0-HK等5種質粒分別注入2/3肝切除后的大鼠肝臟內(nèi)，采用常規(guī)組織學方法、熒光顯微鏡技術以及統(tǒng)計學方法等檢測轉染這些質粒后大鼠的死亡率、組織顯微結構、肝系數(shù)以及肝再生率，以判斷pap對肝再生的影響。
　　體外實驗結果表明，轉染pEGFP-N1-Pap的細胞明顯成梭形，細胞核仁增多，與Pap融合的綠色熒光蛋白(EGFP)主要分布在細胞核核膜周圍，其它轉染細胞株形態(tài)無明顯變化，EGFP主要

5、分布均在細胞核中：生長曲線檢測顯示轉染pEGFP-N1-Pap質粒的細胞增殖最快；PCNA細胞免疫化學和hoechst33258染色檢測表明穩(wěn)定轉染pEGFP-N1-pap質粒的細胞可能促進細胞增殖、抑制凋亡；集落形成率結果顯示穩(wěn)定轉染pEGFP-N1-pap的細胞惡性程度升高；藥物MTT檢測發(fā)現(xiàn)Pap基因能促進BEL-7402細胞生長，但對其耐藥性無明顯影響。體內(nèi)實驗結果表明，轉入pEGFP-N1-Pap質粒后，有炎癥反應發(fā)生；在12