過(guò)表達(dá)Beclin 1誘導(dǎo)的自噬提高了MG63對(duì)Gemcitabine的抵抗與Wnt信號(hào)通路關(guān)系的研究.pdf

1、目的：
　　Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路異常與大多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路在抗腫瘤化療藥物抵抗方面的作用機(jī)制仍不清楚。通過(guò)研究 Beclin1基因過(guò)表達(dá)在 MG63骨肉瘤細(xì)胞自噬以及 MG63骨肉瘤細(xì)胞對(duì)Gemcitabine的抵抗中的作用，和Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路在MG63骨肉瘤細(xì)胞自噬中的作用，探討Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路與Beclin1基因過(guò)表達(dá)M

2、G63骨肉瘤細(xì)胞對(duì)Gemcitabine的抵抗之間的關(guān)系。
　　方法：
　　1.MG63骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)
　　用DMEM培養(yǎng)液加上10%滅活的胎牛血清,在含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MG63骨肉瘤細(xì)胞，待細(xì)胞約90%融合時(shí)，在生物安全柜中進(jìn)行細(xì)胞傳代。加入少許0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA，消化3-5分鐘，倒置顯微鏡下觀察到胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)，完全培養(yǎng)基終止消化，離心去上清（1000 rpm），按1

3、:3比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。
　　2.共焦熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)自噬
　　將DsRed-LC3-GFP連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，與輔助質(zhì)粒Gag-pol和VSVG一起共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集病毒上清后感染靶細(xì)胞。經(jīng)Puromycin篩選后，建立穩(wěn)定表達(dá)DsRed-LC3-GFP的細(xì)胞株。用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞3天做為陽(yáng)性對(duì)照組觀察自噬的發(fā)生。在共焦熒光顯微鏡下觀察靶細(xì)胞熒光表達(dá)情況，沒(méi)有發(fā)生自噬時(shí)，DsRED紅光和GFP綠光都有表達(dá)

4、，發(fā)生自噬時(shí)，主要表現(xiàn)為DsRED紅光為主。
　　3.Western blot檢測(cè)
　　在細(xì)胞蛋白抽提開(kāi)始前加入0.1mol/L PMSF，1×106細(xì)胞用PBS洗兩次，用含有0.1mol/L PMSF的裂解液孵育。細(xì)胞裂解物13000rpm，4℃離心20min。梯度稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)品，配制濃度為20-2000μg/mL的待測(cè)樣品。配制 BCA溶液，顯色反應(yīng)30min，562nm測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液和樣品的吸光度，平行測(cè)三次，計(jì)算待測(cè)樣

5、品濃度。根據(jù)待檢測(cè)蛋白的分子量，配制10%的分離膠，濃縮膠濃度為4%。取待檢測(cè)蛋白樣品20μL上樣，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)0.45μm孔徑NC膜1小時(shí)，將膜完全浸沒(méi)在5%脫脂奶粉-TBST中室溫輕搖1小時(shí)，一抗（anti-Beclin1和anti-LC3B）室溫孵育10min，放4℃過(guò)夜，第二天取膜，在室溫孵育30min，TBST洗膜5次，3min/次，用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L），室溫下輕搖40min，TBST洗

6、膜6次，3min/次。配制ECL溶液，將其滴加到膜上，室溫下避光反應(yīng)3-5min，選擇不等時(shí)間多次膠片曝光，顯影1-2min，定影。
　　4.PCR檢測(cè)Caspase3、Caspase7、BCL-2、cyclin D1、c-FLIP的表達(dá)
　　取貼壁培養(yǎng)的呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的MG63骨肉瘤細(xì)胞約0.5×106個(gè)，培養(yǎng)12小時(shí)后分別給予Gem（10μg/mL）、Gem（50μg/mL）、Beclin1+Gem（10μg/mL）、Bec

7、lin1+Gem（50μg/mL）處理，并設(shè)立空白對(duì)照組。培養(yǎng)24小時(shí)后，用0.125%的胰蛋白酶消化后，PBS洗滌2次，用TRIZOL試劑提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)操作說(shuō)明合成cDNA。根據(jù)Promega公司的M-MLV操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA逆轉(zhuǎn)錄。
　　5.PCR檢測(cè)ATG4、Beclin1、LAMP1、ATG5、ATG12的表達(dá)
　　選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 MG63骨肉瘤細(xì)胞約0.5×106個(gè)，培養(yǎng)12小時(shí)后分別給予Wnt3a(

8、200ng/mL)、XAV939（1μmol/L）處理，設(shè)對(duì)照組。依次進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取、cDNA的合成、總RNA逆轉(zhuǎn)錄以及檢測(cè)基因引物探針的設(shè)計(jì)（方法同4）。
　　6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)
　　將MG63骨肉瘤細(xì)胞以1×106接種于6孔板，培養(yǎng)72小時(shí)后進(jìn)行消化，使細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液，2000rpm離心5min，棄去上清，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。用100μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5μL Annexin-V染色液和5μL P

9、I染色液，室溫下避光孵育20分鐘，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　7.ELISA技術(shù)分析beclin1在MG63骨肉瘤細(xì)胞上清的水平
　　取10μL細(xì)胞上清液用0.05mol/L NaHCO3稀釋到100μL包被ELISA板，室溫下振蕩1.5小時(shí)。PBST洗板3次，加封閉液（PBST加1％脫脂奶粉）350μL/孔，室溫下放置1小時(shí)，PBST洗3次。加封閉液稀釋的胃蛋白酶原一抗100μL/孔，ELISA板于室溫振蕩1小時(shí)，PB

10、ST洗3次。加封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗100μL/孔，ELISA板于室溫振蕩1小時(shí)，PBST洗3次。加入OPD顯色液100μL/孔，避光反應(yīng)約10-30分鐘。1mol/L H2SO4100μL/孔終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)OD450nm。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間整體比較采用單因素/雙因素方差分析，進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較檢驗(yàn)。所有分析均在SPSS16.0軟件中完成，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

11、　　結(jié)果：
　　1.過(guò)表達(dá)Beclin1基因可誘發(fā)MG63骨肉瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生
　　過(guò)表達(dá)Beclin1基因的MG63骨肉瘤細(xì)胞蛋白條帶明顯，而對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)明顯蛋白條帶，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明在 MG63骨肉瘤細(xì)胞中成功的過(guò)表達(dá)了Beclin1基因。過(guò)表達(dá)Beclin1基因的MG63骨肉瘤細(xì)胞其LC3B-Ⅱ蛋白條帶較對(duì)照組明顯，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明 LC3B發(fā)生剪切，即自噬增加

12、。
　　2.Beclin1過(guò)表達(dá)后可減少Gemcitabine誘導(dǎo)的MG63骨肉瘤細(xì)胞凋亡
　　Gemcitabine可誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因（Caspase3、Caspase7）的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡基因（BCL-2，cyclin D1和c-FLIP）的表達(dá)，且呈劑量依賴(lài)性。Beclin1基因過(guò)表達(dá)后會(huì)逆轉(zhuǎn)上述過(guò)程，減少凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。
　　3.激活Wnt信號(hào)通路可降低MG63骨肉瘤細(xì)胞自噬，抑制可促進(jìn)自噬
　　激活

13、 Wnt信號(hào)通路可降低自噬,抑制 Wnt信號(hào)通路可促進(jìn)自噬。抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可顯著增加Beclin1基因的表達(dá)，表明Beclin1基因的表達(dá)可能在Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制自噬方面起一定的作用。
　　4.激活Wnt信號(hào)通路可降低自噬，減少Beclin1基因過(guò)表達(dá)MG63骨肉瘤細(xì)胞對(duì)Gemcitabine的抵抗
　　Gemcitabine可以誘導(dǎo)MG63骨肉瘤細(xì)胞凋亡，Beclin1基因過(guò)表達(dá)

14、MG63骨肉瘤細(xì)胞可減少Gemcitabine誘導(dǎo)的凋亡，激活Wnt信號(hào)通路可降低自噬，增加Beclin1基因過(guò)表達(dá)MG63骨肉瘤細(xì)胞凋亡，從而減少Beclin1基因過(guò)表達(dá)骨肉瘤細(xì)胞對(duì)Gemcitabine的抵抗。應(yīng)用Gemcitabine處理的Beclin1基因過(guò)表達(dá)MG63骨肉瘤細(xì)胞存活率呈劑量依賴(lài)性下降，在應(yīng)用 Gem（40μg/mL）和 Gem（60μg/mL）處理的Beclin1基因過(guò)表達(dá)MG63骨肉瘤細(xì)胞中加用Wnt3a（2

15、00ng/mL）可明顯降低細(xì)胞存活率，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而加用 XAV939（1μmol/L）可明顯提升細(xì)胞存活率，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路通過(guò)下調(diào) Beclin1基因的表達(dá)抑制 MG63骨肉瘤細(xì)胞的自噬，降低Gemcitabine誘導(dǎo)的MG63骨肉瘤細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　Beclin1基因過(guò)表達(dá)可誘發(fā)MG63骨肉瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生，并減少Gemcit

16、abine誘導(dǎo)的MG63骨肉瘤細(xì)胞凋亡。Beclin1過(guò)表達(dá)后可減少Gemcitabine誘導(dǎo)的凋亡，但Wnt信號(hào)通路激活可反向抑制。我們的研究結(jié)果為解決抗腫瘤化療藥物耐藥性的問(wèn)題提供了一個(gè)新的見(jiàn)解。Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常可以促進(jìn)Beclin1介導(dǎo)自噬，從而阻止化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。我們的研究結(jié)果為通過(guò)調(diào)節(jié)異常 Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)自噬和自噬基因Beclin1，提高化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的敏感性提供了