TAK1在卵巢惡性上皮腫瘤中的表達(dá)及其對紫杉醇在SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中的化療增敏研究.pdf

1、卵巢上皮性惡性腫瘤是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，位于婦科惡性腫瘤的第三位，全球每年新診斷病例約24萬人，死亡病例約15萬人。雖然近年來由于TC（紫杉醇、卡鉑）、TP（紫杉醇、順鉑）、D C（多西他賽、卡鉑）等有效化療方案的應(yīng)用，使得卵巢癌的治療效果有了明顯提高，但是其5年生存率也僅僅在25%-30%之間。現(xiàn)在對于復(fù)發(fā)性卵巢癌缺乏有效的治療手段，因此目前對于卵巢上皮性癌的治療效果一直未能與卵巢惡性生殖

2、細(xì)胞腫瘤那樣出現(xiàn)質(zhì)的飛躍，導(dǎo)致卵巢惡性腫瘤致死率居?jì)D科惡性腫瘤的首位。卵巢癌的高死亡率主要是歸功于腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)對細(xì)胞毒類的化療藥物抵抗和一些細(xì)胞克隆發(fā)展成復(fù)發(fā)腫瘤，因此對化療藥物耐藥是卵巢癌治療過程中常見并且是富有挑戰(zhàn)性的問題。
　　轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1（TAK1或稱MAP3K7）是細(xì)胞內(nèi)的分子中心，于1995年經(jīng)對cDNA文庫篩選和蛋白碎片互補(bǔ)分析時在轉(zhuǎn)化生長因子β通路中被發(fā)現(xiàn)，它調(diào)控著NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶MAPK

3、信號通路，在細(xì)胞生存，免疫應(yīng)答，新陳代謝和致癌中起到關(guān)鍵作用，其主要通過TAK1-NF-κB途徑抑制凋亡蛋白酶的激活從而阻止了凋亡細(xì)胞的死亡導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生無限增殖，引起腫瘤的發(fā)生。最近的研究表明TAK1在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)。由此可見TAK1在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用。然而關(guān)于TAK1在卵巢癌中的表達(dá)情況以及TAK1在卵巢癌中的發(fā)生、發(fā)展中作用特別是對于耐受紫杉醇的卵巢癌中的作用，國內(nèi)外相關(guān)的報(bào)道較少。
　　基于此種情況

4、，本研究的目的是對TAK1在卵巢癌組織和接受紫杉醇治療復(fù)發(fā)卵巢癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，并通過RNAi技術(shù)和TAK1的特異抑制劑5Z-7-oxozeaenol抑制卵巢癌SKOV3和OVCAR3細(xì)胞系中的TAK1的表達(dá)，建立耐受醇的SKOV3PR細(xì)胞系，觀察TAK1的表達(dá)情況及其對細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響；建立雌性裸鼠的移植瘤模型，觀察抑制了TAK1后移植瘤對紫杉醇治療的反應(yīng)，探討TAK1在卵巢癌中的預(yù)后價值及TAK1在卵巢癌發(fā)生

5、發(fā)展過程中的作用，試圖建立抑制TAK1在紫杉醇治療卵巢癌中的潛在的抗腫瘤潛能，并期待這些實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)能夠改變卵巢癌患者的臨床治療效果。
　　第一部分：TAK1蛋白在卵巢組織及卵巢癌細(xì)胞中的差異表達(dá)及其臨床意義
　　目的:觀察TAK1在卵巢癌組織及其復(fù)發(fā)組織中的表達(dá)情況，探討TAK1的表達(dá)與卵巢癌的臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系，同時觀察TAK1在SKOV3細(xì)胞和耐受紫杉醇的SKOV3PR細(xì)胞之間的表達(dá)特征。
　　方法：采用

6、western-blotting方法檢測卵巢癌細(xì)胞系SKOV3及耐受紫杉醇的SKOV3PR細(xì)胞系中的TAK1及p-TAK1蛋白的表達(dá)及Q-PCR檢測兩種細(xì)胞中TAK1mRNA的表達(dá)情況，采用免疫組織化學(xué)半定量法檢測了原發(fā)卵巢癌組織和復(fù)發(fā)卵巢癌組織中的TAK1及p-TAK1的表達(dá)情況并隨訪患者的生存情況。
　　結(jié)果：免疫組化結(jié)果分析顯示在復(fù)發(fā)組織中，TAK1的表達(dá)水平要高于原發(fā)組織（p=0.0076），與之相應(yīng)的，p-TAK1的活性

7、在復(fù)發(fā)組織中的活性要高于原發(fā)腫瘤組織(p=0.021)；TAK1的表達(dá)與患者FIGO分期、p53蛋白表達(dá)及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性，但是生存分析曲線顯示高表達(dá)的TAK1與較差的整體生存期（OS）顯著相關(guān)（p=0.031）；TAK1mRNA在SKOVPR細(xì)胞中的表達(dá)要顯著高于SKOV3細(xì)胞（P=0.014）；western blot結(jié)果顯示 TAK1及p-TAK1蛋白在SKOV3的表達(dá)要顯著低于SKOV3PR細(xì)胞系中的表達(dá)(p=0.00

8、8與0.009)。
　　結(jié)論：TAK1參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程，對紫杉醇產(chǎn)生耐受的卵巢癌細(xì)胞表現(xiàn)出TAK1及p-TAK1的過表達(dá)，TAK1可能是卵巢癌的不良預(yù)后分子標(biāo)記物。
　　第二部分：抑制TAK1的表達(dá)對卵巢癌SKOV3及OVCAR3及耐紫杉醇的SKOV3PR細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響
　　目的：通過siRNA和5Z-7-oxozeaenol抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞SKOV3PR細(xì)胞和OVCAR3細(xì)胞中的TAK1的表

9、達(dá)，分析沉默了TAK1的表達(dá)對不同卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲能力的影響，觀察TAK1沉默后紫杉醇對不同卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。
　　方法：使用兩個獨(dú)立的TAK1靶向siRNAs(signalSilence○R siRNAⅠ＃6317和Ⅱ#6318)轉(zhuǎn)染SKOV3和OVCAR3細(xì)胞，同時設(shè)立陰性對照組siRNAs(signalSilence○R control siRNA#6201),western blotting方法檢測不同卵

10、巢癌細(xì)胞中TAK1、p-TAK1蛋白的表達(dá)。使用CCK-8實(shí)驗(yàn)、Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記試驗(yàn)和流水細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染抑制TAK1后的腫瘤細(xì)胞對紫杉醇的敏感性變化及經(jīng)過紫杉醇處理和5Z-7-oxozeaenol處理后的增殖、凋亡以及侵襲能力的變化。
　　結(jié)果：沉默TAK1能夠顯著提高紫杉醇在SKOV3和OVCAR3細(xì)胞中的敏感性，5Z-7-oxozeaenol對于抑制TAK1的磷酸化抑制呈劑量依賴，5Z-7-oxoze

11、aenol增加紫杉醇的細(xì)胞毒性的能力隨著其濃度的增加而顯著增加，在SKOV3細(xì)胞系中如無5Z-7-oxozeaenol處理，紫杉醇的IC50為2.5而在SKOV3PR中，如無5Z-7-oxozeaenol處理，則其IC50值為236。PI染色的SKOV3細(xì)胞使用流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)紫杉醇能夠增加G2/M期細(xì)胞比例，而SKVO3RP細(xì)胞對此并無此種反應(yīng)，而同時給予5Z-7-oxozeaenol處理后，此種現(xiàn)象會再現(xiàn)。凋亡檢測發(fā)現(xiàn)紫杉醇組引起的

12、凋亡與對照組相比較細(xì)胞凋亡明顯上升（p=0.02）而紫杉醇+TAK1抑制劑5Z-7-oxozeaenol組和對照組、5Z-7-oxozeaenol組及單獨(dú)使用紫杉醇組相比較差異有顯著意義（p=0.001）。
　　結(jié)論：沉默TAK1的表達(dá)能夠增強(qiáng)紫杉醇對卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，5Z-7-oxozeaenol提高紫杉醇的細(xì)胞毒作用呈劑量依賴性，耐受紫杉醇的卵巢細(xì)胞對于聯(lián)合使用了TAK1抑制5Z-7-oxozeaenol和紫杉醇更為敏感

13、；聯(lián)合使用紫杉醇和TAK1抑制劑5Z-7-oxozeaenol能夠誘導(dǎo)G2/M捕獲并能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　第三部分：聯(lián)合使用TAK1抑制劑5z-7-oxozeaenol和紫杉醇對無胸腺小鼠種植瘤生長的影響
　　目的：通過TAK1抑制劑5z-7-oxozeaenol聯(lián)合紫杉醇處置卵巢移植瘤動物模型，觀察其對裸鼠卵巢癌移植瘤生長及裸鼠成長的影響并評估其安全性。
　　方法：60只無胸腺雌性小鼠隨機(jī)分成4組（對照組、紫杉醇組、

14、5z-7-oxozeaenol組、紫杉醇聯(lián)合5z-7-oxozeaenol組），每組15只，給予皮下注射SKOV3細(xì)胞5*106個細(xì)胞/每注射；建立卵巢癌移植瘤動物模型，待到皮下腫瘤可觸及時給予紫杉醇8mg/kg和5z-7-oxozeaenol6.5mg/kg處理四周期后，處死小鼠前2小時給予腹膜腔內(nèi)注射BrdU150mg/kg，記錄小鼠體重變化，稱量小鼠脾臟重量及切除的腫瘤重量，腫瘤細(xì)胞懸浮呈單細(xì)胞由流式細(xì)胞儀記錄腫瘤細(xì)胞總數(shù)和陽性染

15、色腫瘤細(xì)胞數(shù)，檢測腫瘤細(xì)胞增殖。
　　結(jié)果：紫杉醇聯(lián)合5z-7-oxozeaenol處理組的移植瘤質(zhì)量要顯著低于其他三組(p<0.01)，BrdU檢測腫瘤細(xì)胞百分比顯著降低（p<0.01）；5z-7-oxozeaenol處理的小鼠顯示了更低的p-TAK1/TAK1比例（p<0.01）；各組之間的小鼠體重及脾臟重量無顯著差異。
　　結(jié)論：紫杉醇聯(lián)合TAK1抑制劑5z-7-oxozeaenol能夠有效的抑制卵巢癌移植瘤的生長，并