Beclin1和HLA在卵巢癌細(xì)胞SKOV3的表達(dá)情況的研究.pdf

1、目的:
　　本實(shí)驗(yàn)通過使用帶有DDK標(biāo)簽的Beclin1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察HLA在人類卵巢癌細(xì)胞SKOV3中的表達(dá)情況，探討自噬基因Beclin1對HLA基因蛋白表達(dá)的影響和與卵巢癌臨床病理學(xué)的關(guān)系，并初步探討B(tài)eclin1在過表達(dá)的情況下對人卵巢癌細(xì)胞SKOV3免疫學(xué)方面的影響，從自噬對免疫影響這一方面進(jìn)一步闡明Beclin1表達(dá)在卵巢癌發(fā)生及進(jìn)展中所起的作用，本研究結(jié)果可為卵巢癌的病因研究及臨床免疫治療提供一定的理論基礎(chǔ)和

2、可行的思路。
　　方法:
　　1利用細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染技術(shù)、Real Time-PCR、RT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)方法研究外源性Beclin1過表達(dá)后對卵巢癌細(xì)胞SKOV3的HLA抗原表達(dá)情況的影響。
　　2通過MTT法分析外源性Beclin1過表達(dá)后對卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖活性的影響情況。
　　3在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞的自噬現(xiàn)象。
　　結(jié)果:
　　1將pCMV6-Entry-

3、Beclin1和pCMV6-Entry表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到SKOV3細(xì)胞中，通過RT-PCR結(jié)果顯示:與空白對照組相比較，轉(zhuǎn)染pCMV6-Entry-Beclin1載體后，Beclin1基因表達(dá)明顯提高，提示表達(dá)載體可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
　　2為了探討B(tài)eclin1和HLA在卵巢癌中的生物學(xué)行為，本實(shí)驗(yàn)采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，將pCMV6-Entry-Beclin1和pCMV6-Entry轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞中，再從mRNA和蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖等

4、方面觀察HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ的表達(dá)情況的變化。
　　2.1pCMV6-Entry-Beclin1轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞(SKOV3-Beclin1 group)后，Beclin1和HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ在mRNA及蛋白表達(dá)水平上均高于空載體組(SKOV3-Entry group)及未轉(zhuǎn)染組(SKOV3 group)。
　　2.2MTT結(jié)果顯示，與空載體組和空白對照組相比，SKOV3-Beclin1組細(xì)胞生長明顯受到抑制。在轉(zhuǎn)染

5、后24h、48h、72h和96h后，SKOV3-Beclin1組細(xì)胞的生長抑制率分別為42.60％，37.87％，24.35％，4.81％.綜上結(jié)果表明，pCMV6-Entry-Beclin1轉(zhuǎn)染后可明顯抑制SKOV3細(xì)胞的增殖活性。
　　2.3RT-PCR檢測各組細(xì)胞中Beclin1基因及HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ等位基因表達(dá)結(jié)果顯示，空白組、轉(zhuǎn)染組和空轉(zhuǎn)染組各組細(xì)胞中Beclin1基因的表達(dá)量分別為0.6609±0.0457，1.

6、5973±0.1491，0.6661±0.0316。HLA-Ⅰ等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C在以上各組細(xì)胞表達(dá)情況分別為0.8223±0.0704,1.6227±0.2427,0.7835±0.0842;0.6785±0.15271,0.4491±0.2191,0.5992±0.1705;0.6626±0.0803,1.2284±0.1742，0.6820±0.0591。HLA-Ⅱ等位基因HLA-DP、HLA-DQ、HLA-

7、DR在以上各組細(xì)胞的表達(dá)情況分別為0.5043±0.1030，1.6283±0.1698,0.4844±0.1731;0.2551±0.1128,1.1219±0.2517,0.3212±0.1598;0.5670±0.0642,1.5132±0.2356,0.5014±0.2524。各組細(xì)胞的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析SNK兩兩比較和非參數(shù)檢驗(yàn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2.4Real Time RT-PCR檢測各組細(xì)

8、胞中Beclin1基因及HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ等位基因表達(dá)結(jié)果顯示，空白組，轉(zhuǎn)染組，空轉(zhuǎn)染組各組細(xì)胞中Beclin1基因表達(dá)分別為1.3861±0.0066，9.2922±0.2715，1.8350±0.1015;HLA-Ⅰ等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C在以上各組細(xì)胞表達(dá)情況分別為5.9848±0.0783,14.5475±0.0545,6.0894±0.0140;1.7167±0.0580,2.7984±0.1515,1.

9、7973±0.0192;3.8161±0.0449,12.1393±0.0463，4.6966±0.1527。HLA-Ⅱ等位基因HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR在以上各組細(xì)胞中表達(dá)的情況分別為6.8787±0.1833，16.7675±0.4850,7.6501±0.4856;2.9097±0.2281,25.5259±0.7104,3.8230±0.1273;6.1550±0.0511,19.1355±0.6053,6.378

10、1±0.1222。各組細(xì)胞的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析SNK兩兩比較和非參數(shù)檢驗(yàn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2.5Western blot法檢測空白組、轉(zhuǎn)染組、空轉(zhuǎn)染組各組細(xì)胞中Beclin1及HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ蛋白抗體表達(dá)結(jié)果顯示，在以上各組細(xì)胞中Beclin1蛋白的表達(dá)量分別為5.6656±0.8535，11.6792±2.8931，5.1258±0.6148。HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ蛋白在以上各組細(xì)胞表達(dá)的情況分

11、別為0.2131±0.0421,0.4208±0.0989,0.2208±0.0564;0.2143±0.0544,0.3503±0.0778，0.2143±0.0543。各組細(xì)胞試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析SNK兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2.6熒光顯微鏡觀察到轉(zhuǎn)染Beclin1組中MDC標(biāo)記的自噬熒光信號強(qiáng)度最高，胞漿內(nèi)出現(xiàn)了明顯的綠色熒光信號。
　　結(jié)論:
　　1自噬基因Beclin1過表達(dá)可以抑