RhoA-ROCK1信號(hào)通路在膿毒癥相關(guān)性ARDS及肺纖維化中的作用及干預(yù)研究.pdf

1、研究背景:
　　急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)在重癥醫(yī)學(xué)科中具有很高的死亡率，而引發(fā)ARDS最常見(jiàn)的病因是膿毒癥。由重度膿毒癥引起的ARDS會(huì)觸發(fā)炎癥反應(yīng)及肺纖維化進(jìn)程。越來(lái)越多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究提示肺成纖維細(xì)胞的增殖分化在ARDS相關(guān)性肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中具有重要的病理意義。然而對(duì)ARDS相關(guān)性肺纖維化的細(xì)胞分子基礎(chǔ)的研究至今為止仍然模糊。ICU中ARDS和ARDS相關(guān)性肺纖維化的發(fā)生率及病死率仍居高不下。認(rèn)識(shí)肺纖維化發(fā)病機(jī)理

2、并且為減輕纖維化程度提供合適的干預(yù)方案，這至關(guān)重要。
　　目的:
　　通過(guò)觀察小鼠肺纖維化模型及RhoA激酶抑制劑（法舒地爾）干預(yù)后肺組織中RhoA/ROCK1通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。探究法舒地爾對(duì)肺纖維化(pulmonaryfibrosis，PF)的治療作用及RhoA/ROCK1通路在纖維化發(fā)生發(fā)展的作用。在細(xì)胞水平通過(guò)觀察脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)對(duì)肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)RhoA/ROCK1通

3、路活性的影響，并觀察RhoA激酶抑制劑法舒地爾對(duì)LPS刺激下MRC-5細(xì)胞增殖、分化的作用，進(jìn)一步探討RhoA/ROCK1通路在MRC-5細(xì)胞增殖分化中的作用，進(jìn)而為ARDS的治療尋求新的思路。
　　研究方法:
　　(1)將90只小鼠，嚴(yán)格按照隨機(jī)化原則歸為3組;對(duì)照組(n=30):肺部氣溶膠給藥套裝給予5mg/kg的生理鹽水，作為對(duì)照每日固定時(shí)間腹腔注射生理鹽水20mg/kg;脂多糖組(n=30):肺部氣溶膠給藥套裝給予5

4、mg/kg的脂多糖（濃度為1mg/mL），每日固定時(shí)間腹腔注射生理鹽水20mg/kg/天;法舒地爾組(n=30):肺部氣溶膠給藥套裝給予5mg/kg的脂多糖（濃度為1mg/mL），同樣每日固定時(shí)間腹腔注射法舒地爾20mg/kg/天。分別于模型成功后第三天、一周、二周、四周每組各麻醉處死5只小鼠，摘取雙肺。取左肺放置于潔凈空EP管中備用于Westernblot，檢測(cè)第3天肺組織中GTP-RhoA，Rho激酶(ROCK1)，肌球蛋白輕鏈磷酸

5、酶靶亞單位1(Myosin phosphatase target subunit1，MYPT1)，p-MYPT1，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá);RT-PCR檢測(cè)α-SMA的mRNA水平。其中右肺置裝有福爾馬林的小管中，用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察組織結(jié)構(gòu)變化。
　　(2)將MRC-5細(xì)胞分為四組:空白對(duì)照組，LPS組(LPS:10 ug/mL)，低劑量組（法舒地爾:15 umol/mL+LPS:10 ug/mL）和高劑

6、量組（法舒地爾:30umol/mL+LPS:10 ug/mL），細(xì)胞去血清培養(yǎng)24 h。Rho pull-down分析法測(cè)定RhoA活性;Westemblot檢測(cè)GTP-RhoA，ROCK1，MYPT1， p-MYPT1，α-SMA的表達(dá);RT-PCR檢測(cè)α-SMA的mRNA水平;通過(guò)CCK-8試劑盒和EDU細(xì)胞增殖（細(xì)胞成像）試劑盒測(cè)定MRC-5細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)果:
　　(1)脂多糖組RhoA活性，ROCK1蛋白表

7、達(dá)，ROCK1下游底物MYPT1的磷酸化及α-SMA蛋白表達(dá)較空白組均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。藥物處理組(Fasudil)可顯著降低RhoA活性，ROCK1蛋白表達(dá)及ROCK1下游底物MYPT1的磷酸化及α-SMA蛋白表達(dá)(P＜0.05)。對(duì)照組肺組織的病理學(xué)改變不明顯，沒(méi)有顯著的纖維化改變，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)很少，肺泡間隔無(wú)可見(jiàn)增厚。脂多糖組肺組織病理學(xué)改變明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔明顯增厚，肺纖維化改變顯著;法舒

8、地爾組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少，肺泡間隔稍稍增厚，與脂多糖組相比有輕微的肺纖維化改變。
　　(2) LPS明顯上調(diào)肺成纖維細(xì)胞RhoA活性和ROCK1蛋白表達(dá)(P＜0.05），增加ROCK1下游底物MYPT1的磷酸化(P＜0.05)，誘導(dǎo)α-SMA的表達(dá)(P＜0.05）并且提高細(xì)胞增殖率（P＜0.05）。法舒地爾(Fasudil，F(xiàn)AS)可以抑制LPS誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞增殖分化，且劑量稍高組法舒地爾的抑制作用更加明顯（高劑量組vs低劑量