F9細(xì)胞中CHIR99021下調(diào)Dnmt31基因的機(jī)制研究.pdf

1、表觀遺傳是在不改變DNA的序列的情況下對(duì)DNA或染色體的修飾。DNA甲基化是主要的表觀遺傳修飾，具有重要的調(diào)控功能。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)能夠催化甲基從S腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移到DNA。哺乳動(dòng)物中的DNMT家族有五個(gè)成員:DNMT1，DNMT2，DNMT3A，DNMT3B，DNMT3L，其中DNMT3L因缺少催化結(jié)構(gòu)域而不具有任何催化活性，但會(huì)與DNMT3A和DNMT3B相互作用促進(jìn)它們的活

2、性。
　　Wnt信號(hào)通路是胚胎發(fā)育過程中重要的組成，其中經(jīng)典Wnt通路依賴β-catenin轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，通過與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子(T-cell factor/lymphoidenhancer-binding factor， TCF/LEF)結(jié)合，激活或抑制下游基因的表達(dá)。CHIR99021與PD0325901能夠起到抑制細(xì)胞分化的作用，其中CHIR99021是常用的GSK3β的抑制劑，通過抑制此酶活性，使β-cate

3、enin在核內(nèi)積累，達(dá)到Wnt后續(xù)的轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳遞。
　　本文首先利用實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)，確定了不同濃度CHIR99021對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶家族基因的表達(dá)影響，發(fā)現(xiàn)對(duì)Dnmt31基因有明顯下調(diào)作用，而對(duì)于Dnmt3a，Dnmt3b等其余家族基因沒有明顯作用。利用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)確定了針對(duì)小鼠F9細(xì)胞，最適的CHIR99021處理濃度為10μM，并以此為重點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)研究，確定CHIR99021下調(diào)基因的具體機(jī)制。
　　通過構(gòu)建pCMV

4、-Myc-β-catenin、pCDNA3.1-β-catenin和pCDNA3.1-β-catenin S37A載體，利用核質(zhì)蛋白分離提取實(shí)驗(yàn)以及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CHIR99021對(duì)F9細(xì)胞處理后，β-catenin蛋白的總表達(dá)量有明顯提高，并且細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin含量都比對(duì)照組高，說明，CHIR99021可以通過抑制GSK3β來增加細(xì)胞質(zhì)中β-catenin的穩(wěn)定性，并且入核量也隨之增高。通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

5、證明CHIR99021會(huì)對(duì)Wnt/β-catenin經(jīng)典通路造成影響，激活該通路。過表達(dá)β-catenin后，Dnmt31基因的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，因此可得，在小鼠F9細(xì)胞中CHIR99021能夠通過抑制GSK3β，使β-catenin在細(xì)胞核中積累，激活Wnt/β-catenin經(jīng)典通路，最終導(dǎo)致Dnmt31基因的抑制。
　　β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后，通常會(huì)與TCF/LEF復(fù)合體共同作用，并激活基因的轉(zhuǎn)錄，而對(duì)于本文研究基因Dn

6、mt31的抑制效果很少見。此復(fù)合體中起到抑制效果的只有TCF3蛋白，其余成員起轉(zhuǎn)錄激活效果，而近期研究對(duì)TCF3的抑制機(jī)制并不明確，而且對(duì)其在經(jīng)典Wnt通路的作用沒有準(zhǔn)確和唯一的答案，因此，我對(duì)TCF3在此機(jī)制中的作用進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)利用RNA干擾，免疫熒光染色，實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，確定下調(diào)Tcf3(Tcf7l1)基因的表達(dá)會(huì)對(duì)Dnmt31基因有上調(diào)的影響，并且Tcf3和β-catenin基因在經(jīng)過CHIR99021處理