中藥復(fù)方牛貝消核提取物對結(jié)核分枝桿菌作用機制的研究.pdf

1、目的:評價牛貝消核驗方治療結(jié)核病的臨床療效;了解結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv在Middle brook7H9液體培養(yǎng)基中的生長規(guī)律和牛貝消核提取物對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv增殖的影響;研究牛貝消核提取物對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv蛋白質(zhì)組的影響，確定牛貝消核作用的關(guān)鍵蛋白，闡明牛貝消核提取物抗結(jié)核的作用機制，為發(fā)現(xiàn)新的抗結(jié)核藥物靶標(biāo)和新藥研發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.牛貝消核驗方治療結(jié)核病的臨床療效評價。對1

2、998年～2012年就診于四川省內(nèi)江仁愛醫(yī)院傳染科和內(nèi)江陳氏診所的90例結(jié)核病患者的臨床資料進行回顧性研究。
　　2.牛貝消核提取物對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv增殖的影響。在接種有結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的Middle brook7H9液體培養(yǎng)基中加入蒸餾水為陰性對照組，加入異煙肼為陽性對照組，加入牛貝消核提取物為實驗組，每隔7天取100μL培養(yǎng)物，10倍梯度稀釋，涂板，培養(yǎng)3-4周菌落計數(shù)(CFU)，繪制細菌生長曲線。

3、r>　　3.牛貝消核提取物對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv蛋白質(zhì)組的影響。在培養(yǎng)至對數(shù)期的結(jié)核菌Middle brook7H9液體培養(yǎng)物中，加入蒸餾水為陰性對照組，加入異煙肼為陽性對照組，加入牛貝消核提取物為實驗組，分別于加入藥物前以及加入藥物后6h和7d取出培養(yǎng)物，應(yīng)用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)比較分析牛貝消核提取物作用前后結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv蛋白表達譜的差異。
　　結(jié)果:
　　1.牛貝消核驗方治療結(jié)核病的臨床療效評價:治療

4、1～2個療程后，湯劑組83例患者中治愈46例(55.42％)，顯效29例(34.94％)，有效6例(7.23％)，無效2例(2.41％)，總有效率97.59％;散劑組7例患者中，治愈5例(71.43％)，顯效2例(28.57％)，總有效率100％。
　　2.牛貝消核提取物對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv增殖的影響:培養(yǎng)28天后陰性對照組菌落數(shù)增多[(CFUs/ml) Log10=5.93±0.11]，INH組菌落數(shù)為0，牛貝消核提取

5、物組菌落數(shù)減少[(CFUs/ml) Log10=4.31±1.09]，各組間有顯著性差異(P=0.0118，0.01＜P＜0.05)。
　　3.牛貝消核提取物對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv蛋白質(zhì)組的影響:與陰性對照組相比，牛貝消核提取物組有142個差異蛋白斑點，INH組有147個差異蛋白斑點，合計149個;選取其中的71個斑點進行質(zhì)譜鑒定，得到41個高可信度蛋白，其中INH組有35個（7個上調(diào)，28個下調(diào)），牛貝消核提取物組有39

6、個（5個上調(diào)，34個下調(diào)），兩組共同差異蛋白為33個。分析其生物學(xué)功能，可知:參與免疫反應(yīng)的有免疫蛋白MPT64(immunogenic protein MPT64)、角質(zhì)酶培養(yǎng)濾液蛋白21(CFP21)、富于丙氨酸和脯氨酸的分泌蛋白Apa(alanine and proline-rich secreted protein Apa);參與蛋白合成的有50S核糖體蛋白L7/L12（50S ribosomal protein L7/L12）

7、、30S核糖體蛋白S1(30S ribosomal proteinS1)、觸發(fā)因子(trigger factor)、分子伴侶GroEL(molecular chaperone GroEL)、熱休克蛋白X(heat shock protein hspX);參與能量代謝的蛋白有:磷酸甘油酸變位酶(phosphoglyceromutase)、磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase)、磷酸丙酮酸水合酶(phospho

8、pyruvate hydratase)、轉(zhuǎn)醇醛酶(transaldolase)、腺苷酸激酶(adenylate kinase)、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system，PTS)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白ⅡA(glucose transportersubunitⅡA)和糖原累積調(diào)節(jié)蛋白GarA(glycogen accumulation regulator GarA);參與抗氧化應(yīng)激的蛋白有:2-半胱氨酸過氧化物還原酶（2

9、-Cys peroxiredoxin）、硫氧還蛋白(thioredoxin)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)和DNA饑餓/固定相保護蛋白(DNAstarvation/stationary phase protection protein，Dsp);參與氨基酸合成的蛋白有:磷酸甘油酸脫氫酶(phosphoglycerate dehydrogenase)、γ-谷氨酰磷酸還原酶(gamma-glutamyl pho

10、sphatereductase)和4-羥基-tetrahydrodipicolinate還原酶(4-hydroxy-tetrahydrodipicolinatereductase);與細菌的應(yīng)激力有關(guān)的蛋白有:熱休克蛋白X(heat shock protein hspX)和普遍應(yīng)激蛋白家族(Universal stress protein family)。其中抗氧化應(yīng)激、糖酵解和熱休克蛋白等與結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染有關(guān)。
　　結(jié)論