miR-30C介導(dǎo)的GAGE12I信號(hào)通路促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移和增殖的研究.pdf

1、背景:
　　胃癌是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的惡性腫瘤，其造成患者死亡人數(shù)居所有惡性腫瘤致死人數(shù)的第二位。胃癌一旦發(fā)生便以較快的速度進(jìn)展，較易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除胃癌組織是目前相對(duì)有效的治療方式。但由于胃癌細(xì)胞的高浸潤(rùn)性和高轉(zhuǎn)移性，對(duì)于中晚期胃癌患者而言手術(shù)療效并不令人滿(mǎn)意。因此，在基因水平上進(jìn)一步闡明胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，有助于胃癌的治療及預(yù)后水平的提高。
　　本研究通過(guò)基因芯片技術(shù)，相對(duì)于非轉(zhuǎn)移性的胃癌組織在轉(zhuǎn)移性的胃癌組織中

2、篩選出數(shù)百個(gè)差異表達(dá)基因。進(jìn)一步分析顯示在26個(gè)表達(dá)差異最為明顯的基因中包括了GAGE家族中的GAGE12I及GAGE12D等成員。GAGE基因家族可在腫瘤組織和正常睪丸組織中表達(dá)，而在其它正常組織中不表達(dá)。有報(bào)道顯示GAGE基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物能夠引起免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，因此其表達(dá)的產(chǎn)物又被稱(chēng)為腫瘤-睪丸抗原。有研究顯示GAGE基因與腫瘤患者較差的臨床預(yù)后相關(guān)，而包括GAGE12I等家族成員在胃癌中的生物學(xué)調(diào)節(jié)作用尚不清楚。本研究的前期實(shí)驗(yàn)

3、提示GAGE12I等家族成員在轉(zhuǎn)移性的胃癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，提示其可能與胃癌的進(jìn)展特別是與胃癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。GAGE12I對(duì)胃癌細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及增殖的調(diào)節(jié)作用值得進(jìn)一步研究。GAGE12I在胃癌中的表達(dá)模式能否成為胃癌患者的生物學(xué)標(biāo)記物，以及其異常表達(dá)的上游調(diào)節(jié)機(jī)制均需要進(jìn)一步探討。
　　mircoRNAs是一類(lèi)短鏈且非編碼RNA，它們通過(guò)堿基互補(bǔ)的作用方式結(jié)合在靶基因的3’-UTR區(qū)域，在轉(zhuǎn)錄后的水平抑制靶基因的蛋白表達(dá)。

4、在本研究中，通過(guò)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)GAGE12I可能受到miR-30C(miR-30C-1-3P和miR-30C-2-3P)，miR-887-5p， miR-320b以及miR-590-3p等多個(gè)miRNAs的負(fù)向調(diào)控。這些miRNAs是否真正發(fā)揮對(duì)GAGE12I的調(diào)節(jié)作用，以及其是否通過(guò)負(fù)向調(diào)控GAGE12I發(fā)揮調(diào)節(jié)胃癌進(jìn)展也值得深入研究。
　　方法:
　　1.mRNA基因芯片在胃癌組織中檢測(cè)轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達(dá)基因。收集原發(fā)的胃

5、癌新鮮標(biāo)本，其中未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非轉(zhuǎn)移性胃癌組織及伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移性胃癌組織各5例，進(jìn)行mRNA芯片檢測(cè)。對(duì)轉(zhuǎn)移性胃癌和非轉(zhuǎn)移性胃癌中的基因表達(dá)進(jìn)行對(duì)比，按照基因在轉(zhuǎn)移組中表達(dá)上調(diào)比值≧2.0或下調(diào)比值≦0.5，并且滿(mǎn)足P≦0.05進(jìn)行差異基因的初步篩選。
　　2.RT-qPCR檢測(cè)基因mRNA及miRNA的表達(dá)。將收集的胃癌新鮮組織或是胃癌細(xì)胞樣本，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)各

6、樣本中基因表達(dá)情況。對(duì)miRNA的檢測(cè)，首先使用miRNA提取試劑盒提取石蠟組織中的miRNA，再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及RT-qPCR檢測(cè)。
　　3.目的基因蛋白表達(dá)的檢查。收集132例胃癌石蠟標(biāo)本，免疫組織化學(xué)(IHC)技術(shù)檢測(cè)目的蛋白在胃癌組織中的表達(dá)情況。在胃癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GAGE12I過(guò)表達(dá)載體或miR-30C后，Western-blot檢測(cè)相關(guān)目的蛋白相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)情況。
　　4.Transwell檢測(cè)胃癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能

7、力。將GAGE12I過(guò)表達(dá)載體或miRNAs mimics及相應(yīng)的對(duì)照載體或mimics轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系，進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)能力的改變。
　　5.細(xì)胞增殖和凋亡檢測(cè)。將GAGE12I過(guò)表達(dá)載體或miRNA mimics及相應(yīng)對(duì)照轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，通過(guò)MTS、EDU及流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡能力的改變。
　　6.動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)。以慢病毒感染的方式在胃癌細(xì)胞系中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)GAGE12I。再將感

8、染后的胃癌細(xì)胞通過(guò)皮下和尾靜脈注射的方式注入裸鼠體內(nèi)。5周后與對(duì)照組相比，觀察裸鼠皮下成瘤情況和遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移的情況。分析GAGE12I對(duì)胃癌細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及增殖情況的影響。
　　7.mRNA表達(dá)譜芯片分析受GAGE12I調(diào)控的信號(hào)通路。收集過(guò)表達(dá)GAGE12I及對(duì)照組胃癌細(xì)胞，進(jìn)行mRNA基因表達(dá)譜檢測(cè)。分析差異性表達(dá)的信號(hào)通路，并結(jié)合信號(hào)通路的功能篩選可能受GAGE12I調(diào)控的信號(hào)通路。并以RT-qPCR和western-b

9、lot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證受調(diào)控的信號(hào)通路。
　　8.ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGF的表達(dá)。收集過(guò)表達(dá)GAGE12I組及對(duì)照組的胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行ELISA試驗(yàn)操作，檢測(cè)GAGE12I對(duì)細(xì)胞外泌VEGF表達(dá)的影響。
　　9.miRNA的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證。首先通過(guò)軟件對(duì)可能結(jié)合在GAGE12I-3'UTR區(qū)域的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)構(gòu)建GAGE12I-3'UTR雙熒光素酶載體，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA對(duì)GAGE12I表達(dá)

10、的調(diào)控作用。再進(jìn)行western-blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA對(duì)GAGE12I蛋白表達(dá)水平的調(diào)控，從而最終確定能夠直接調(diào)節(jié)GAGE12I的miRNA。
　　10.數(shù)據(jù)分析。兩組數(shù)據(jù)之間的差異采用Student t-test的檢驗(yàn)方法。Kaplan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)法分析GAGE12I以及miR-30C的表達(dá)與胃癌患者術(shù)后生存的關(guān)系。GAGE12I與miR-30C之間的關(guān)系采用Spearman's相關(guān)分析。P＜0

11、.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.基因芯片結(jié)果顯示GAGE12I等GAGE基因家族成員的表達(dá)在轉(zhuǎn)移性胃癌組織中顯著上調(diào)?；蛐酒Y(jié)果顯示在轉(zhuǎn)移性的胃癌組中發(fā)現(xiàn)700個(gè)顯著下調(diào)的基因和450個(gè)顯著上調(diào)的基因。在差異最顯著的26個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)了GAGE12I及GAGE12D等GAGE家族的基因。
　　2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)GAGE12I及GAGE12D在轉(zhuǎn)移性胃癌組織中表達(dá)上調(diào)。在擴(kuò)大樣本量的胃癌新鮮組織樣本中進(jìn)行R

12、T-qPCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示GAGE12I及GAGE12D在轉(zhuǎn)移性胃癌組織樣本中的表達(dá)顯著升高，該結(jié)果與基因芯片的結(jié)果一致。IHC結(jié)果顯示GAGE12I蛋白主要在胃癌細(xì)胞的胞核中表達(dá)，并且再次證實(shí)其在轉(zhuǎn)移性的胃癌組中明顯上調(diào)。
　　3.GAGE12I促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:BGC823，AGS及MKN45細(xì)胞的遷移與浸潤(rùn)能力在過(guò)表達(dá)GAGE12I后明顯增加。動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GAGE12I在動(dòng)物體內(nèi)明顯促進(jìn)癌細(xì)胞

13、的局部浸潤(rùn)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力。
　　4.GAGE12I在動(dòng)物體內(nèi)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:GAGE12I在體外對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖或凋亡能力沒(méi)有明顯的影響。然而，動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)GAGE12I后胃癌細(xì)胞的增殖能力明顯增加，腫瘤的生長(zhǎng)速度加快，即GAGE12I在動(dòng)物體內(nèi)明顯增加胃癌細(xì)胞增殖能力。
　　5.GAGE12I上調(diào)VEGF信號(hào)通路活性?；蛐酒Y(jié)果顯示在胃癌細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)GAGE12I能夠明顯上調(diào)VEGF信號(hào)通路

14、的表達(dá)。后續(xù)通過(guò)RT-qPCR及western-blot等實(shí)驗(yàn)也表明GAGE12I能夠明顯上調(diào)VEGF信號(hào)通路的表達(dá)，相關(guān)基因如VEGF，Paxillin，P38，pHSP27等表達(dá)明顯上調(diào)。
　　6.Snail及E-cad等EMT相關(guān)基因的表達(dá)也受GAGE12I的顯著調(diào)控。RT-qPCR及western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GAGE12I在胃癌細(xì)胞中顯著上調(diào)Snail的表達(dá)和下調(diào)E-cad的表達(dá)。
　　7.GAGE12I通

15、過(guò)上調(diào)VEGF促進(jìn)胃癌血管新生。ELISA實(shí)驗(yàn)顯示GAGE12I能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞外泌的VEGF增加，EDU實(shí)驗(yàn)顯示以GAGE12I組胃癌細(xì)胞上清液培養(yǎng)人內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC后，其增殖能力明顯增加。動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示GAGE12I組的皮下瘤體中CD34陽(yáng)性(CD34+)的微血管數(shù)量明顯高于對(duì)照組。在人胃癌組織中，GAGE12I高表達(dá)組中CD34+微血管數(shù)也明顯多于GAGE12I低表達(dá)組中CD34+微血管數(shù)。
　　8.GAGE12I受miR

16、-30C的負(fù)向調(diào)控。軟件預(yù)測(cè)可能對(duì)GAGE12I具有負(fù)向調(diào)控作用的miRNAs，結(jié)合miRNAs相關(guān)功能研究篩選出miR-30C-1-3P，miR-30C-2-3P，miR-887-5p， miR-320b以及miR-590-3p等多個(gè)miRNAs。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p能夠明顯抑制GAGE12I的表達(dá);western-blot進(jìn)一步證實(shí)GAGE12I的表達(dá)能夠受miR-30c-1-3p及m

17、iR-30c-2-3p的負(fù)向調(diào)控。相關(guān)分析也顯示miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p的表達(dá)均與GAGE12I的表達(dá)均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　9.GAGE12I及miR-30C的表達(dá)與胃癌患者的生存預(yù)后密切相關(guān)。GAGE12I高表達(dá)預(yù)示著胃癌患者較差的總體生存率及無(wú)瘤生存率，而miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p的高表達(dá)則預(yù)示著胃癌患者較高的總體生存率，miR-30c-1-3p高表達(dá)還預(yù)示著較高的無(wú)瘤生存率

18、。
　　10.miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)。 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在胃癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p均能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的遷移浸潤(rùn)能力，但對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論:
　　1.GAGE12I及GAGE12D在轉(zhuǎn)移性胃癌組織中高表達(dá)，并且GAGE12I的高表達(dá)預(yù)示胃癌患者較差的臨床預(yù)后。
　　2.GA

19、GE12I能夠在體內(nèi)、外明顯提高胃癌細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移能力。GAGE12I在體內(nèi)還能夠上調(diào)胃癌增殖和血管新生的能力。
　　3.GAGE12I在胃癌細(xì)胞內(nèi)通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)通路活性及癌細(xì)胞EMT而促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。
　　4.GAGE12I的表達(dá)受miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p的負(fù)向調(diào)控，并且高表達(dá)的miR-30c-1-3p及miR-30c-2-3p預(yù)示胃癌患者較好的臨床預(yù)后。
　　5.miR-3