褐藻多糖對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲活性及巨噬細(xì)胞功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤和腫瘤相關(guān)致死原因之一，每年新增病例約30萬(wàn)，死亡約15萬(wàn)人。盡管目前已經(jīng)存在成熟的綜合治療手段，OSCC在近20年中的5年生存率僅升高了5％。治療效果不佳的主要原因之一在于OSCC在疾病早期即容易發(fā)生局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞侵襲活性的干預(yù)措施將可能為OSCC的治療帶來(lái)希望。細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)行為主要

2、依賴于細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化，包括微絲、微管和中間纖維。細(xì)胞骨架參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的整個(gè)過(guò)程，為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)提供動(dòng)力，并參與運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和分泌。驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesin，KIF)家族是一類與細(xì)胞骨架關(guān)系極為緊密的動(dòng)力蛋白，與微管結(jié)合參與細(xì)胞分裂和胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程。許多KIF成員參與微管的組裝和分解，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)活性。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)KIF家族成員在OSCC腫瘤局部高表達(dá)，表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。這提示KIF可能是OSCC發(fā)展、

3、浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控因子，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。
　　除腫瘤細(xì)胞自身的生物學(xué)行為之外，腫瘤發(fā)展還受到周圍組織的調(diào)控。腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，其中巨噬細(xì)胞所占比例最高。巨噬細(xì)胞根據(jù)外源性信號(hào)的調(diào)節(jié)可分化為具有抗腫瘤活性的M1型細(xì)胞和促進(jìn)腫瘤的M2型細(xì)胞。腫瘤局部巨噬細(xì)胞的數(shù)量和表型、功能均與OSCC的侵襲轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。這提示OSCC是一種免疫敏感性腫瘤，靶向巨噬細(xì)胞的免疫治療可能成為OSCC的可能治療手段

4、。
　　褐藻多糖是一種提取白海洋植物褐藻的天然硫酸化多糖類物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種活性，是良好的營(yíng)養(yǎng)保健品和治療藥物?？鼓[瘤是褐藻多糖的主要功能之一。褐藻多糖不僅影響腫瘤細(xì)胞的凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為，還對(duì)機(jī)體多種免疫細(xì)胞活性產(chǎn)生影響。然而，目前尚不清楚褐藻多糖對(duì)OSCC的發(fā)展是否存在影響。在本研究中，我們檢測(cè)了褐藻多糖對(duì)舌鱗癌細(xì)胞系CAL27侵襲活性的影響以及對(duì)巨噬細(xì)胞募集和馴化的作用，并初步探究了作用機(jī)制。

5、我們發(fā)現(xiàn)褐藻多糖通過(guò)KIF4A/MMP-2的作用通路調(diào)節(jié)CAL27細(xì)胞的侵襲活性，并通過(guò)調(diào)節(jié)CAL27細(xì)胞CCL3的分泌調(diào)節(jié)其對(duì)巨噬細(xì)胞的募集和馴化作用。
　　第一部分褐藻多糖通過(guò)KIF4A/MMP-2通路調(diào)節(jié)口腔癌細(xì)胞侵襲活性
　　目的
　　KIF家族成員在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用，但其在OSCC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。該部分將探究KIF家族成員在OSCC細(xì)胞侵襲行為中的影響，以及天然提取物褐藻多糖對(duì)O

6、SCC細(xì)胞KIF表達(dá)及侵襲活性的調(diào)控作用。
　　方法
　　1.不同濃度(0，10，50，100，200μg/ml)的褐藻多糖處理人舌鱗癌細(xì)胞系CAL27細(xì)胞48h，transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分析褐藻多糖對(duì)CAL27侵襲活性的影響。
　　2.CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)100μg/ml褐藻多糖對(duì)CAL27細(xì)胞增殖活性的影響
　　3.利用qRT-PCR技術(shù)探究褐藻多糖對(duì)CAL27細(xì)胞金屬基質(zhì)蛋白酶(matrixmetallop

7、roteinases，MMPs)表達(dá)的影響。
　　4.利用qRT-PCR技術(shù)分析褐藻多糖對(duì)CAL27細(xì)胞KIF家族成員表達(dá)的影響。
　　5.向CAL27細(xì)胞轉(zhuǎn)染KIF4A siRNA以干擾其表達(dá)，利用transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和qRT-PCR技術(shù)分別探究KIF4A敲除對(duì)CAL27細(xì)胞侵襲活性和MMP-2表達(dá)的影響。
　　結(jié)果
　　1.100及200μg/ml的褐藻多糖均顯著抑制人舌鱗癌細(xì)胞系CAL27細(xì)胞的侵襲活

8、性，其中100μg/ml的褐藻多糖對(duì)CAL27細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。
　　2.100μg/ml的褐藻多糖顯著抑制CAL27細(xì)胞MMP-2的轉(zhuǎn)錄水平，但對(duì)MMP-9和MMP-14表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　3.褐藻多糖顯著抑制CAL27細(xì)胞KIF4A的轉(zhuǎn)錄水平，但對(duì)其他KIF家族成員如KIF1B、KIF2A、KIF3A、KIF3B和KIF5B的轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯影響。
　　4.敲除CAL27細(xì)胞KIF4A表達(dá)顯著抑制其MMP-2轉(zhuǎn)錄和侵

9、襲活性。
　　結(jié)論
　　我們的研究首次發(fā)現(xiàn)褐藻多糖抑制人舌鱗癌細(xì)胞系CAL27的侵襲和MMP-2表達(dá)，這一作用可能需要KIF4A的參與。我們的研究結(jié)果提示KIF4A可能成為OSCC侵襲行為調(diào)節(jié)的可能作用靶點(diǎn)。
　　第二部分褐藻多糖通過(guò)CCL3影響OSCC細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞的募集和馴化
　　目的
　　巨噬細(xì)胞影響口腔癌的發(fā)展過(guò)程，是口腔癌患者免疫治療的潛在作用靶點(diǎn)。褐藻多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，之前的研究顯示其影響巨

10、噬細(xì)胞的遷移活性。然而目前尚不清楚褐藻多糖對(duì)口腔癌微環(huán)境中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞有何影響。在該部分的研究中，我們探究了褐藻多糖對(duì)OSCC細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞募集和馴化的影響，并初步探究了作用機(jī)制。
　　方法
　　1.體外誘導(dǎo)生成THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞。收集褐藻多糖處理后的CAL27細(xì)胞上清，利用transwell實(shí)驗(yàn)探究褐藻多糖作用上清對(duì)THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞募集的影響。
　　2.利用qRT-PCR和ELISA方法探究褐藻多糖對(duì)CA

11、L27細(xì)胞趨化因子表達(dá)的影響。
　　3.向有/無(wú)褐藻多糖作用的CAL27條件培養(yǎng)基中加入CCL3中和抗體，檢測(cè)CCL3對(duì)CAL27細(xì)胞募集THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞的影響。
　　4.用有/無(wú)褐藻多糖作用的CAL27條件培養(yǎng)基處理THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞。利用qRT-PCR和ELISA技術(shù)檢測(cè)CAL27細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)巨噬細(xì)胞促炎及抗炎細(xì)胞因子分泌的影響。
　　5.向有/無(wú)褐藻多糖作用的CAL27條件培養(yǎng)基中加入CCL3中和抗

12、體，之后處理THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞。利用qRT-PCR和ELISA技術(shù)檢測(cè)CCL3對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響。
　　結(jié)果
　　1.褐藻多糖處理后的CAL27細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞的募集作用顯著增強(qiáng)。
　　2.褐藻多糖顯著促進(jìn)CAL27細(xì)胞CCL3的轉(zhuǎn)錄和分泌，而對(duì)其他CCL趨化因子的表達(dá)無(wú)明顯影響，如CCL2，CCL4，CCL5和CCL22等.
　　3.加入CCL3中和抗體后，CAL27細(xì)胞條件

13、培養(yǎng)基對(duì)THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞的募集作用顯著減弱。
　　4.褐藻多糖處理后的CAL27細(xì)胞條件培養(yǎng)基促進(jìn)THP-1來(lái)源巨噬細(xì)胞M1型因子IL-1和TNF-α的表達(dá)，而抑制M2型因子CCL22的表達(dá)。
　　5.向CAL27條件培養(yǎng)基中加入CCL3中和抗體顯著逆轉(zhuǎn)褐藻多糖對(duì)IL-1和TNF-α表達(dá)的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論
　　我們的研究發(fā)現(xiàn)褐藻多糖促進(jìn)CAL27細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞的募集作用，并馴化巨噬細(xì)胞向M1方向分化。這