鬼臼毒素衍生物ZM-10對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌KB細(xì)胞株的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：鬼臼毒素(podophyllotoxin)是由中草藥中分離提取的具有抗腫瘤活性的有效成分，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。但其水溶性差、抗瘤譜窄和較為嚴(yán)重的骨髓抑制作用限制了其廣泛應(yīng)用，而經(jīng)過(guò)了一系列改造過(guò)程形成的鬼臼毒素新衍生物ZM-10可減少其毒副作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究ZM-10作用下KB細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變、生長(zhǎng)狀況等指標(biāo)，探討其對(duì)于口腔鱗狀細(xì)胞癌的應(yīng)用前景。 材料和方法： 1.實(shí)驗(yàn)材料：口腔鱗狀細(xì)胞癌KB細(xì)胞株2 實(shí)驗(yàn)方

2、法；口腔鱗狀細(xì)胞細(xì)胞癌KB細(xì)胞接種于含10％胎牛血清，100單位/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)瓶置于37℃、5％C02飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每1～2天換培養(yǎng)液一次。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面時(shí)，用0.25％胰蛋白酶消化，傳代。MTT法檢測(cè)ZM-10的抗癌活性，確定其對(duì)KB細(xì)胞的半數(shù)生長(zhǎng)抑制濃度后進(jìn)行促凋亡機(jī)制的研究，各實(shí)驗(yàn)均分為四組：A組(0.1％DMSO處理24小時(shí))，B組(1.5gr

3、aol/L ZMm-10處理24小時(shí))，C組(3μmol/L ZM-10處理24小時(shí))，D組(6gmol/LZM-10處理24小時(shí))，應(yīng)用倒置光顯微鏡、熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳分析ZM-10對(duì)KB細(xì)胞染色體DNA斷裂的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析ZM-10對(duì)KB細(xì)胞周期的影響和誘導(dǎo)凋亡率的變化；應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞P53、Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果： 1.MT

4、T法發(fā)現(xiàn)ZM-10對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌KB細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度(IC50)為3μmol/L。通過(guò)觀察對(duì)KB細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響，發(fā)現(xiàn)在不同濃度的ZM-10作用下，能顯著抑制KB細(xì)胞的增殖，并具有量效關(guān)系。 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)B、C、D三個(gè)實(shí)驗(yàn)組均有特征性的凋亡峰形成。對(duì)照組A組凋亡率為15.5±1.53％，實(shí)驗(yàn)組B組凋亡率為18.6±3.8％，C組凋亡率為25.6±2.87％，D組凋亡率為37.2±4.5％，加藥各組(B、C、D組)的

5、凋亡率與對(duì)照組A組相比有顯著性差異(p＜0.05)。且結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比ZM-10可在抑制細(xì)胞各時(shí)相的同時(shí)，使細(xì)胞周期阻斷在G2+M期。 3.ZM-10處理KB細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)的改變.熒光顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)KB細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生聚集、碎裂，細(xì)胞核固縮呈均一的致密物，進(jìn)而斷裂，細(xì)胞膜不斷出芽、脫落，細(xì)胞變成數(shù)個(gè)大小不等的凋亡小體，并且隨著ZM-10濃度的加大，鏡下這種細(xì)胞形態(tài)的變化愈來(lái)愈明顯，表明凋亡細(xì)胞的

6、比例逐漸增加，具有劑量依賴性。 4 在經(jīng)典的DNA降解斷裂檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，抽提B、C、D組富集小分子量DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，呈現(xiàn)典型的“DNA梯子”(DNA ladder)與A組形成明顯對(duì)照，表明ZM-10誘導(dǎo)KB細(xì)胞發(fā)生凋亡。 5 通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞的DNA含量進(jìn)行測(cè)定，可見(jiàn)B、C、D組于正常G0/G1細(xì)胞群前出現(xiàn)DNA低染細(xì)胞群，稱為“A0細(xì)胞群”或“亞G1細(xì)胞群，Sub-G1”即凋亡細(xì)胞群，該現(xiàn)象被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生

7、凋亡的標(biāo)志之一，且凋亡細(xì)胞的比例隨著ZM-10濃度的升高而增大，呈一定的劑量依賴性。綜上結(jié)果可以認(rèn)為ZM-10能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。 6 ZM-10對(duì)KB細(xì)胞凋亡相關(guān)基因P53、Caspase-3、Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)的影響。RT-PCR結(jié)果顯示B、C、D細(xì)胞中P53，Caspase-3和Bax的mRNA的表達(dá)升高，同時(shí)降低了Bcl-2的mRNA的表達(dá)，同對(duì)照組A組相比均有顯著性差異。提示ZM-10誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用是

8、依靠上調(diào)了Caspase-3，p53和Bax mRNA的表達(dá)，同時(shí)協(xié)同下調(diào)抑制凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。 結(jié)論： (1)ZM-10可誘導(dǎo)KB細(xì)胞發(fā)生凋亡。(2)不同同濃度ZM-10作用于KB細(xì)胞，使細(xì)胞周期發(fā)生改變，并且可將腫瘤細(xì)胞阻斷在G2+M期。(3)不同同濃度ZM-10作用于KB細(xì)胞，影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)相關(guān)癌基因及抑癌基因P53、Caspase-3、Bcl-2和Bax mRNA的表達(dá)。(4)ZM-10