用Caco-2細(xì)胞研究參附方在吸收層面的配伍規(guī)律.pdf

1、工作目的:
　　參附方由人參（五加科多年生草本植物人參的干燥根）和附子（毛茛科多年生草本植物烏頭子根的加工品）兩味中藥組成。本課題建立Caco-2細(xì)胞單層模型，從吸收層面探求參附方配伍規(guī)律，為進(jìn)一步深入研究提供技術(shù)支撐，并為中藥復(fù)方組分配伍優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支撐。
　　研究方法:
　　制備人參水提物和附子水提物，用UPLC/MS測(cè)定，選擇其中的標(biāo)志性成分并進(jìn)行定量。將Caco-2細(xì)胞以1×105個(gè)/cm2的密度接種于內(nèi)插小室

2、，培養(yǎng)21天，建立單層模型，并以跨膜電阻值、陽(yáng)性對(duì)照藥熒光黃和普萘洛爾的表觀通透系數(shù)(apparentpermeability coefficient, Papp)值來(lái)評(píng)價(jià)模型的完整性、緊密性和通透性。進(jìn)行人參水提物、附子水提物和兩者配伍的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，用HPLC/MS對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)樣品中的標(biāo)志性成分進(jìn)行定量，計(jì)算Papp和外排比。分別用羅丹明123外排實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot法來(lái)測(cè)定P-gp的活性、MDR1 mRNA的表

3、達(dá)和P-gp的蛋白水平。
　　成果:
　　人參中有一定含量、可代表人參藥理作用的2種三醇型人參皂苷（人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf）、3種二醇型人參皂苷（人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rc）和齊墩果烷型酸性人參皂苷Ro被選作標(biāo)志性成分。附子中有一定含量、可代表附子藥理毒理作用的3種雙酯型生物堿（烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿）、2種單酯型生物堿（苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿）和3種醇胺型生物堿（附子靈、尼奧林、塔拉

4、烏頭胺）被選作標(biāo)志性成分。建立并驗(yàn)證Caco-2細(xì)胞單層模型后，初步分析人參水提物的雙向跨膜，僅發(fā)現(xiàn)人參皂苷Ro可能存在主動(dòng)外排作用，因此將研究重心轉(zhuǎn)向附子。附子水提物在Caco-2模型雙向跨膜時(shí)，其中的雙酯型毒性生物堿成分存在活躍的外排作用，而且人參水提物的加入能夠增強(qiáng)它們的外排，減少它們的吸收。在附子水提物雙向跨膜實(shí)驗(yàn)中加入P-gp抑制劑，發(fā)現(xiàn)雙酯型生物堿成分的外排被抑制，表明P-gp可能參與它們的外排轉(zhuǎn)運(yùn)。進(jìn)一步進(jìn)行這些雙酯型生物

5、堿單體的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)，并加抑制劑判斷，發(fā)現(xiàn)它們的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包含多個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體。其中，P-gp和BCRP在外排轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用已得到證實(shí)，同時(shí)不排除OCT參與吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性。最后，通過(guò)羅丹明123外排實(shí)驗(yàn)、實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot法來(lái)測(cè)定P-gp的活性、MDR1 mRNA的表達(dá)和P-gp的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)人參水提物能通過(guò)誘導(dǎo)MDR1 mRNA的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)P-gp的蛋白表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)P-gp的功能。
　　結(jié)論:
　　人參可