黃芪多糖通過多胺和鈣離子調(diào)節(jié)IEC-6細(xì)胞遷移的研究.pdf

1、研究背景：
　　胃腸黏膜損傷是胃腸道疾病的發(fā)病基礎(chǔ)之一。多種胃腸疾病存在胃腸黏膜損傷的病理改變。以益氣健脾法治療慢性胃炎、消化性潰瘍、炎癥性腸病等疾病證屬脾虛者有確切療效，益氣健脾方藥對(duì)胃腸道相關(guān)病癥的治療作用可能與其保護(hù)胃腸黏膜完整及促進(jìn)黏膜損傷后修復(fù)的作用有密切關(guān)系。胃腸黏膜是人體更新最快的組織，具有很強(qiáng)的自我修復(fù)能力。胃腸黏膜損傷后修復(fù)包括快速整復(fù)階段和后續(xù)的修復(fù)階段?？焖僬麖?fù)階段主要在損傷后數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)發(fā)生，由損傷附近的

2、剩余的有活性的細(xì)胞向損傷部位遷移并重新覆蓋損傷部位，此過程不依賴細(xì)胞增殖。在小腸上皮細(xì)胞(IEC-6)的研究表明，多胺對(duì)細(xì)胞遷移是必需的。多胺可通過增加細(xì)胞電壓門控鉀通道蛋白Kv1.1表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞膜電位超極化而調(diào)控Ca2+內(nèi)流驅(qū)動(dòng)力;儲(chǔ)存操縱性鈣通道(SOC)是細(xì)胞Ca-2+內(nèi)流主要通道之一，TRPC1作為SOC通道蛋白，對(duì)調(diào)控Ca2+內(nèi)流驅(qū)動(dòng)力和[Ca2+]cyt起重要作用。STIM1作為胞內(nèi)鈣庫(kù)Ca2+感應(yīng)器是激活SOC的關(guān)鍵指標(biāo)

3、;胞內(nèi)鈣庫(kù)Ca2+耗竭時(shí)STIM1從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移位到漿膜與TRPC1形成STIM1/TRPC1復(fù)合體，進(jìn)而增強(qiáng)TRPC1介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流而促進(jìn)細(xì)胞遷移。STIM2是SOC的負(fù)調(diào)控蛋白，多胺通過改變ST1M1和ST1M2的比率而調(diào)控TRPC1介導(dǎo)的Ca2+信號(hào);[Ca2+]cyt增加則激活下游的Rho-GTPases，MLC磷酸化增加，刺激應(yīng)力纖維形成和細(xì)胞骨架重排而促進(jìn)細(xì)胞遷移。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)益氣健脾方藥如白術(shù)、黨參、黃

4、芪、甘草提取物（多糖、黃酮提取物等）及四君子湯糖等可促進(jìn)IEC-6細(xì)胞遷移，作用機(jī)制與其影響多胺信號(hào)通路有關(guān)，其中Ca2+調(diào)控是關(guān)鍵指標(biāo)。
　　研究目的：
　　篩選藥效活性較高的黃芪多糖組分為受試藥，觀察其對(duì)小腸上皮細(xì)胞(IEC-6)遷移過程多胺信號(hào)通路（尤其是Ca2+調(diào)控指標(biāo)）的影響，探討益氣健脾中藥黃芪促進(jìn)胃腸黏膜損傷修復(fù)的作用機(jī)制及藥效物質(zhì)，為其臨床治療胃腸黏膜損傷的療效機(jī)制提供參考。
　　研究方法：
　　

5、1.黃芪多糖提取、分離和純化:黃芪藥材經(jīng)水提醇沉法、Sevag去蛋白、DEAE-52纖維素柱層析、Sephadex葡聚糖柱層析，分別得到黃芪多糖1、2、3、4樣品;苯酚-硫酸法測(cè)定黃芪多糖各樣品的多糖含量;高效液相色譜法進(jìn)行黃芪多糖3、4樣品純度分析。
　　2.在細(xì)胞遷移模型篩選受試藥:劃痕法IEC-6細(xì)胞遷移模型觀察黃芪多糖4種樣品對(duì)細(xì)胞遷移的影響，篩選出促進(jìn)細(xì)胞藥理活性最佳的多糖樣品為后續(xù)研究受試藥。
　　3.作用機(jī)制指

6、標(biāo)檢測(cè):①RT-qPCR測(cè)定TRPC1、STIM1、STIM2 mRNA表達(dá)。②Western Blot檢測(cè)Kv1.1、TRPC1、STIM1、STIM2、RhoA、Rac1、Cdc42蛋白表達(dá)。③流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞膜電位(Em)、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子水平([Ca2+]cyt)。④免疫熒光法檢測(cè)STIM1蛋白表達(dá)及分布。⑤免疫沉淀法檢測(cè)STIM1/TRPC1、STIM1/STIM2復(fù)合體蛋白表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　1.黃芪

7、多糖提取、分離和純化:①黃芪多糖1、2、3、4的得率分別為:5.64％、3.34％、1.50％、6.5‰。②黃芪多糖1、2、3、4的多糖含量分別為31.0％、50.9％、66.3％、45％。以“黃芪多糖3”多糖含量最高。
　　2.黃芪多糖各樣品對(duì)細(xì)胞遷移的影響:黃芪多糖4種樣品均能促進(jìn)細(xì)胞遷移，以“黃芪多糖3”促進(jìn)細(xì)胞遷移藥效最佳，故確定為后續(xù)實(shí)驗(yàn)受試藥。實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)為:20mg/L～160mg/L。
　　3.“黃芪多糖3”（

8、以下簡(jiǎn)稱“黃芪多糖”）對(duì)細(xì)胞遷移的影響:黃芪多糖能促進(jìn)細(xì)胞遷移，逆轉(zhuǎn)DFMO（多胺合成抑制劑）對(duì)細(xì)胞遷移的抑制，提示黃芪多糖促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用與其提高細(xì)胞內(nèi)多胺含量有關(guān)。
　　4.黃芪多糖對(duì)細(xì)胞遷移多胺信號(hào)通路Ca2+調(diào)控的影響
　　(1)對(duì)Ca2+調(diào)控上游指標(biāo)的影響:①提高鉀通道蛋白Kv1.1表達(dá);逆轉(zhuǎn)DFMO對(duì)Kv1.1表達(dá)的抑制;②提高細(xì)胞膜電位超極化水平，逆轉(zhuǎn)DFMO所致的膜電位去極化。提示黃芪多糖可通過激活鉀通道和

9、提高細(xì)胞膜電位而增加Ca2+內(nèi)流驅(qū)動(dòng)力。
　　(2)對(duì)Ca2+調(diào)控指標(biāo)的影響:①促進(jìn)胞內(nèi)Ca2+感應(yīng)器STIM1蛋白移位至細(xì)胞漿膜，改善DFMO對(duì)STIM1移位的抑制，提高STIM1在細(xì)胞膜的表達(dá);②提高STIM1mRNA和蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)DFMO對(duì)STIM1 mRNA和蛋白表達(dá)的抑制;減少Ca2+負(fù)調(diào)控因子STIM2 mRNA和蛋白表達(dá);抑制DFMO所致的STIM2 mRNA和蛋白表達(dá)的升高。③增加TRPC1/STIM1復(fù)合體蛋白

10、表達(dá)，減少STIM1/STIM2復(fù)合體蛋白表達(dá);增加DFMO負(fù)荷時(shí)TRPC1/S TIM1復(fù)合體中TRPC1、STIM1蛋白表達(dá);減少DFMO負(fù)荷下STIM1/STIM2復(fù)合體中STIM2蛋白表達(dá)。提示黃芪多糖可通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣庫(kù)Ca2+感應(yīng)指標(biāo)進(jìn)而影響TRPC1介導(dǎo)的Ca2+信號(hào)。
　　(3)對(duì)鈣通道蛋白和[Ca2+]cyt的影響:①提高鈣通道蛋白TRPC1 mRNA和蛋白表達(dá)，減少DFMO所致的TRPC1 mRNA和蛋白表達(dá)抑制

11、;②提高[Ca2+]cyt，逆轉(zhuǎn)DFMO所致的[Ca2+]cyt降低;若去除細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流途徑（使用無鈣培養(yǎng)液），則不但無鈣對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)顯著減少，且黃芪多糖促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用也明顯減弱。提示黃芪多糖可通過增強(qiáng)TRPC1介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流、提高[Ca2+]cyt而促進(jìn)細(xì)胞遷移。
　　(4)對(duì)Ca2+調(diào)控下游指標(biāo)的影響:提高Rho-GTPase(RhoA、Rac1、Cdc42)蛋白表達(dá);逆轉(zhuǎn)DFMO對(duì)RhoA、Rac1、Cdc