外源性骨橋蛋白對肝再生中細胞增殖的作用研究.pdf

1、目的：骨橋蛋白(Ostepontin，OPN)作為一種多功能蛋白，能夠參與多種病理活動，如參與各種組織中的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、血管生成、纖維化和癌癥等的發(fā)生。大量的研究已闡明OPN在調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移、炎癥反應(yīng)、纖維化和癌癥進展等過程中具有重要作用。我們在前期研究發(fā)現(xiàn)，肝再生與細胞增殖、活化和炎癥反應(yīng)等生理活動密切相關(guān)，然而目前關(guān)于OPN在肝再生中的作用機制尚未闡明。因此，本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，分別從體內(nèi)和體外研究外源性O(shè)PN對大鼠肝

2、再生的影響。
　　方法：在體外研究中分別用大鼠重組OPN蛋白(recombinant rat OPN，rrOPN)和小鼠OPN抗體(Mouse Osteopontin Antibody, mOPN-Ab)處理大鼠肝細胞BRL-3A，MTT檢測細胞增殖情況，流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布情況，qRT-PCR和Western Blot方法檢測OPN通路相關(guān)基因和受通路調(diào)節(jié)的細胞增殖相關(guān)靶基因的表達變化。在體內(nèi)研究中，首先將rrOPN通過尾

3、靜脈注入2/3肝切除后的大鼠體內(nèi)，分別于3h、24h和72h后取材，測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）的含量，ELISA方法檢測血清中IL-6和TNF-α的含量，H&E染色檢測再生肝組織學(xué)變化，免疫熒光檢測再生肝組織中細胞增殖標(biāo)志物PCNA的表達水平，qRT-PCR和Western Blot方法檢測OPN通路相關(guān)基因

4、及受通路調(diào)節(jié)的細胞增殖相關(guān)靶基因的表達變化。
　　結(jié)果：體外研究發(fā)現(xiàn)，rrOPN可能通過促進其受體CD44和ITGAV的表達，從而激活下游的JAK/STAT、ERK1/2和PI3K/AKT信號通路，調(diào)節(jié)下游靶基因/蛋白CCND1、BCL-2和BAX的表達，參與調(diào)控肝細胞周期進程，促進肝細胞增殖。而OPN-Ab則通過抑制其下游信號通路中相關(guān)蛋白的表達，從而抑制肝細胞增殖。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，rrOPN能夠顯著增加部分肝切除后3h血清中IL

5、-6和TNF-α的含量，HE染色結(jié)果顯示，rrOPN在部分肝切除后24h再生肝組織炎癥反應(yīng)明顯，72h肝組織中細胞核的數(shù)目顯著增多;免疫熒光檢測結(jié)果顯示，rrOPN在部分肝切除后24和72h促進肝細胞增殖。此外，qRT-PCR和Western Blot結(jié)果表明，rrOPN能夠通過JAK/STAT、PI3K/AKT、ERK1/2和NF-κB信號通路調(diào)節(jié)下游靶基因/蛋白CCND1和BAX的表達，從而促進細胞增殖和肝再生。
　　結(jié)論：綜