離體椎間盤模型中壓應(yīng)力對髓核組織的生物效應(yīng)及促退變機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　本研究在該智能化仿生組織培養(yǎng)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過相關(guān)策略改善椎間盤中央髓核組織營養(yǎng)供應(yīng)并優(yōu)化相關(guān)培養(yǎng)參數(shù)，優(yōu)效建立了離體椎間盤器官培養(yǎng)模型;然后在該模型中，通過施加不同參數(shù)的仿生壓應(yīng)力，觀察了壓應(yīng)力對椎間盤髓核細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)“窗”;最后，深入研究了高負(fù)荷壓應(yīng)力促進(jìn)椎間盤退變的可能途徑及其機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分
　　1.分離兔椎間盤，去除兩端骨性終板保留軟骨終板，隨后將離體兔椎間盤隨機(jī)分為對照

2、組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組中對椎間盤進(jìn)行預(yù)處理，即手術(shù)去除約1/3外層纖維環(huán)后，低濃度胰酶控制性疏松殘余外層纖維環(huán)組織;對照組中椎間盤不做該處理。
　　2.椎間盤預(yù)處理后，體外用亞甲藍(lán)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)觀察兩組椎間盤中溶質(zhì)擴(kuò)散效率，用組織形態(tài)學(xué)染色(HE)觀察椎間盤軟骨終板和內(nèi)層纖維環(huán)的結(jié)構(gòu)變化。
　　第二部分
　　1.按第一部分方法分離豬椎間盤并進(jìn)行椎間盤培養(yǎng)前預(yù)處理。
　　2.利用該智能化仿生組織培養(yǎng)系統(tǒng)，首先將豬椎間盤置于不

3、同葡萄糖水平(低糖:1.0 g/L;普糖:2.0 g/L;高糖:4.5 g/L)、不同滲透壓水平(低滲:330 mOsm/kg，等滲:430 mOsm/kg，高滲:550 mOsm/kg)和不同血清水平（5％，10％和20％）培養(yǎng)環(huán)境中進(jìn)行灌注培養(yǎng)7天，通過檢測髓核細(xì)胞活力、髓核細(xì)胞胞外基質(zhì)代謝相關(guān)分子的基因表達(dá)和髓核組織中生化組分(GAG和HYP)含量，篩選出最能維持髓核組織生物活性的葡萄糖水平、滲透壓水平和血清水平。
　　第三

4、部分
　　1.按第一和第二部分方法進(jìn)行豬椎間盤分離和椎間盤培養(yǎng)前預(yù)處理，并建立離體豬椎間盤器官培養(yǎng)模型。
　　2.利用該智能化仿生組織培養(yǎng)系統(tǒng)對灌注培養(yǎng)中的椎間盤進(jìn)行施力刺激7天，分別觀察不同仿生壓應(yīng)力大小(0.1 MPa、0.2 MPa、0.4 MPa、0.8 MPa和1.3 MPa，其他應(yīng)力參數(shù)為:1.0Hz的應(yīng)力頻率，2h每天的應(yīng)力施加時間)、不同仿生壓應(yīng)力頻率(0.1Hz、0.5 Hz、1.0 Hz、3.0 Hz和5

5、.0 Hz，其他應(yīng)力參數(shù)為:0.4 MPa的應(yīng)力大小，2h每天的應(yīng)力施加時間）和不同仿生壓應(yīng)力作用時間(1h/每天、2h/每天、4h/每天和8h/每天，其他應(yīng)力參數(shù)為:0.4 MPa的應(yīng)力大小，1.0 Hz的應(yīng)力頻率)對椎間盤髓核組織的生物學(xué)效應(yīng)。沒有進(jìn)行壓應(yīng)力刺激的椎間盤視作對照組。
　　第四部分
　　1.按第一部分方法分離大鼠椎間盤，獲取中央髓核組織后，用胰酶和Ⅰ型膠原酶消化法獲取髓核細(xì)胞，采用雙相接種的方法將髓核細(xì)胞接

6、種至支架材料上。然后將含髓核細(xì)胞的支架材料置于該智能化仿生組織培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行灌注培養(yǎng)5天。同時，每天對髓核細(xì)胞施加不同負(fù)荷的壓應(yīng)力刺激4h，具體分組為無應(yīng)力對照組、低負(fù)荷壓應(yīng)力（2％壓縮形變）組和高負(fù)荷壓應(yīng)力（20％壓縮形變）組，壓應(yīng)力頻率為1.0 Hz。同時，在高負(fù)荷壓應(yīng)力組中，利用通路抑制劑SB203580和清除劑NAC觀察p38 MAPK通路和胞內(nèi)活性氧(ROS)蓄積在高負(fù)荷壓應(yīng)力對髓核細(xì)胞影響中的作用。培養(yǎng)結(jié)束后，分析各組髓核細(xì)

7、胞增殖情況、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性、G1期細(xì)胞周期阻滯比例、衰老相關(guān)標(biāo)志物(p16和p53)的基因和蛋白表達(dá)、端粒酶活性、胞內(nèi)ROS蓄積情況、髓核細(xì)胞胞外基質(zhì)代謝和p38 MAPK通路活性。
　　2.分離大鼠椎間盤后，利用該智能化仿生組織培養(yǎng)系統(tǒng)，建立大鼠離體椎間盤器官培養(yǎng)模型。對離體大鼠椎間盤組織進(jìn)行施力灌注培養(yǎng)10天，分組為:無壓應(yīng)力對照組、低負(fù)荷壓應(yīng)力(0.1 MPa)組和高負(fù)荷壓應(yīng)力(1.3 MPa)組，壓應(yīng)力施加頻率

8、為1.0 Hz，每天施加時間為4h。培養(yǎng)結(jié)束后，分析各組髓核細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性、衰老相關(guān)標(biāo)志物(p16和p53)的基因和蛋白表達(dá)、端粒酶活性、胞內(nèi)ROS蓄積情況、髓核細(xì)胞胞外基質(zhì)代謝和p38 MAPK通路活性。
　　第五部分
　　1.按第一部分分離大鼠椎間盤，獲取中央髓核組織后，用胰酶和Ⅰ型膠原酶消化法獲取髓核細(xì)胞，采用雙相接種的方法將髓核細(xì)胞接種至支架材料上。
　　2.將含髓核細(xì)胞的支架材料置于該智能化仿

9、生組織培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行灌注培養(yǎng)5天。同時，每天對髓核細(xì)胞施加不同負(fù)荷的壓應(yīng)力刺激4h，具體分組為無應(yīng)力對照組、低負(fù)荷壓應(yīng)力（2％壓縮形變）組和高負(fù)荷壓應(yīng)力（20％壓縮形變）組，壓應(yīng)力頻率為1.0Hz。施力培養(yǎng)結(jié)束后，分析髓核細(xì)胞凋亡情況、Caspase3活性、凋亡相關(guān)分子(Bcl-2，Bax，Caspase3)的基因表達(dá)、凋亡相關(guān)分子(Bcl-2，Bax，Cleaved-caspase3)的蛋白表達(dá)、N-CDH的基因和蛋白表達(dá)，PI3K/

10、Akt通路活性及下游GSK-3β的活性。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.椎間盤器官培養(yǎng)前經(jīng)該預(yù)處理方法處理后，內(nèi)層纖維環(huán)和上下端軟骨終板沒有明顯結(jié)構(gòu)性破壞，并且溶質(zhì)分子更加容易擴(kuò)散至椎間盤髓核組織。
　　2.培養(yǎng)周期中，與對照組椎間盤相比，實(shí)驗(yàn)組椎間盤髓核組織細(xì)胞活力明顯增高、胞外基質(zhì)大分子的基因和蛋白表達(dá)升高、胞外基質(zhì)降解酶的基因表達(dá)下調(diào)、髓核組織主要胞外基質(zhì)組分的含量明顯升高。
　　第二部分

11、　　1.椎間盤在不同葡萄糖水平、不同滲透壓水平和不同血清水平培養(yǎng)7天后，發(fā)現(xiàn)高糖(4.5 g/L)、等滲(430 mOsm/kg)和10％血清的培養(yǎng)條件能較好地維持椎間盤髓核組織細(xì)胞活力、胞外基質(zhì)大分子及基質(zhì)降解酶抑制因子的基因表達(dá)、胞外基質(zhì)主要生化組分(GAG和HYP)的含量，同時這些培養(yǎng)條件可一定程度上降低基質(zhì)降解酶的基因表達(dá)。
　　2.與新鮮髓核組織比較，椎間盤在該優(yōu)化培養(yǎng)環(huán)境中（高糖、等滲、10％血清）培養(yǎng)14天后，髓核組

12、織在細(xì)胞活力、細(xì)胞形態(tài)及分布、組織親水性，和胞外基質(zhì)合成代謝方面仍保持較好的生物活性。
　　第三部分
　　1.各壓應(yīng)力組間比較，在1.3 MPa組、5.0 Hz組和8h組中，椎間盤髓核組織中細(xì)胞凋亡率明顯增高，胞外基質(zhì)大分子表達(dá)降低，基質(zhì)降解酶的表達(dá)升高，髓核組織GAG的含量下降，髓核組織collagenⅡ蛋白表達(dá)降低。
　　2.與無壓應(yīng)力對照組比較，其他壓應(yīng)力大小(0.1-0.4 MPa)組、壓應(yīng)力頻率(0.1-3.

13、0Hz)組和壓應(yīng)力作用時間(1-4 h)組在髓核細(xì)胞活力、髓核組織胞外基質(zhì)代謝相關(guān)分子的表達(dá)和髓核組織GAG含量上可保持相對“健康”的狀態(tài)。
　　第四部分
　　1.髓核細(xì)胞三維培養(yǎng)模型和椎間盤器官培養(yǎng)模型中，相對于低負(fù)荷壓應(yīng)力組和對照組而言，高負(fù)荷壓應(yīng)力可增加髓核細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性，抑制髓核細(xì)胞增殖活性和端粒酶活性，上調(diào)衰老相關(guān)標(biāo)志物(p16和p53)的表達(dá)，降低髓核細(xì)胞胞外基質(zhì)生物合成能力。同時，高負(fù)荷壓應(yīng)力可

14、顯著增加胞內(nèi)ROS蓄積，并增加p38 MAPK通路活性。
　　2.髓核細(xì)胞三維培養(yǎng)模型中，在高負(fù)荷壓應(yīng)力下，加入ROS清除劑NAC后，發(fā)現(xiàn)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性降低，髓核細(xì)胞增殖活性和端粒酶活性增加，衰老相關(guān)標(biāo)志物(p16和p53)的表達(dá)下調(diào)，髓核細(xì)胞胞外基質(zhì)生物合成能力也有增強(qiáng)。另外，NAC可有效地減少髓核細(xì)胞胞內(nèi)ROS蓄積，但NAC對p38 MAPK通路的活性無明顯影響。
　　第五部分
　　1.相對于對照組和低

15、負(fù)荷壓應(yīng)力組而言，高負(fù)荷壓應(yīng)力下髓核細(xì)胞凋亡率和Caspase3活性明顯增加，抗凋亡分子Bcl-2的表達(dá)降低，促凋亡分子(Bax和Caspase3/Cleaved-caspase3)的表達(dá)增加。同時發(fā)現(xiàn)高負(fù)荷壓應(yīng)力下，N-CDH的表達(dá)和PI3K/Akt通路活性明顯降低，但GSK-3β蛋白活性增強(qiáng)。
　　2.高負(fù)荷壓應(yīng)力下，髓核細(xì)胞過表達(dá)N-CDH后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率和Caspase3活性降低、抗凋亡分子Bcl-2的表達(dá)升高，促凋亡分

16、子(Bax和Caspase3/Cleaved-caspase3)的表達(dá)下降，同時PI3K/Akt通路活性增加，但GSK-3β蛋白活性減弱。
　　結(jié)論：
　　1.本研究建立了一種椎間盤培養(yǎng)前預(yù)處理方法，該預(yù)處理方法可促進(jìn)溶質(zhì)分子擴(kuò)散至椎間盤中央髓核髓核組織;在14天的離體椎間盤器官灌注培養(yǎng)周期中，該方法能保持較穩(wěn)定的髓核細(xì)胞活力和胞外基質(zhì)合成。
　　2.本研究在智能化仿生組織培養(yǎng)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了椎間盤體外培養(yǎng)時的培養(yǎng)

17、基條件，發(fā)現(xiàn)高糖(4.5 g/L)、等滲(430 mOsm/kg)和10％血清組合的優(yōu)化培養(yǎng)條件能使椎間盤髓核組織保持與新鮮髓核組織相近的生物活性。
　　3.本研究中證明高強(qiáng)度、高頻率及長時間的壓應(yīng)力刺激均可促進(jìn)離體椎間盤髓核組織中細(xì)胞凋亡并破壞胞外基質(zhì)的自穩(wěn)態(tài);但一定范圍的壓應(yīng)力大小(0.1-0.4 MPa)、壓應(yīng)力頻率(0.1-3.0 Hz)和壓應(yīng)力作用時間(1-4 h)可使離體椎間盤髓核組織保持相對“健康”的生物活性。