用于分離昆明小鼠治療性胚胎干細胞的囊胚生成途徑相關問題研究.pdf

1、本研究采用昆明小鼠做為試驗動物，針對體細胞克隆胚胎囊胚發(fā)育率低，獲取其胚胎干細胞困難的問題，選擇合適濃度的組蛋白去乙?；种苿═SA）分別作用于體細胞核移植重構(gòu)胚的融合和激活階段，比較了TSA在不同階段對重構(gòu)胚發(fā)育的影響。旨在通過研究供核體細胞在去核卵母細胞內(nèi)的核基因重塑修復與重編程過程，分析和探索提高體細胞克隆胚胎囊胚發(fā)育率的有效方法。針對孤雌胚胎干細胞獲取新途徑中，有性生殖胚胎與無性生殖孤雌胚胎嵌合發(fā)育，能夠在早期胚胎細胞間通過旁

2、分泌與自分泌因素和晚期胚胎發(fā)育階段通過胚胎誘導因素的作用下，促進孤雌胚發(fā)育的理論可行性，本研究通過性別鑒定的方法選擇雄性有性生殖胚胎與無性生殖MⅡ期卵母細胞孤雌激活胚胎嵌合發(fā)育，并可以通過性別鑒定的方法將這種嵌合囊胚分離得到的內(nèi)細胞團細胞進行來源標記，旨在通過性別鑒定的方法建立有性生殖胚胎輔助與其嵌合發(fā)育的無性生殖孤雌胚胎生成干細胞和有效分選分離這種干細胞的新途徑。針對孤雌胚胎干細胞獲取新途徑中，通過抑制體外培養(yǎng)過程中MⅠ期卵母細胞第一

3、極體的排出，獲取含雙倍體基因組核型的成熟卵母細胞，孤雌激活這種卵母細胞能夠獲得類似于體細胞克隆胚胎核型的原理，研究MⅠ期卵母細胞雙倍體基因組核型獲取途徑，探討了小鼠MⅡ期卵母細胞孤雌激活體系是否能成功應用于MⅠ期卵母細胞的孤雌激活，并對不同體外胚胎發(fā)育培養(yǎng)液對這種MⅠ期孤雌胚胎的體外培養(yǎng)效果進行了觀察，旨在研究Ml期卵母細胞雙倍體基因組核型人工激活發(fā)育為孤雌胚胎的可能性及其早期胚胎體外培養(yǎng)發(fā)育的潛力，探索治療性克隆胚胎孤雌干細胞生成的新

4、途徑。試驗結(jié)果如下： 1.組蛋白去乙酰化抑制劑（TSA）對體細胞核移植重構(gòu)胚囊胚生產(chǎn)效果的影響 依據(jù)體細胞克隆胚胎囊胚生產(chǎn)效率低的原因與供體核染色質(zhì)和受體卵質(zhì)之間互作異常、影響體細胞染色質(zhì)解聚和激活表達程序出現(xiàn)紊亂有關，本試驗利用組蛋白去乙?；柑禺愋砸种苿㏕SA（trychostatin A）能夠抑制重構(gòu)胚早期組蛋白去乙酰化的作用特點，對重構(gòu)胚發(fā)育早期的融合階段和激活階段分別或共同進行添加TSA處理，觀察其對重構(gòu)胚發(fā)育

5、狀況的影響，以揭示組蛋白乙?；?去乙?；饔迷诤藘?nèi)染色質(zhì)重編程過程中所發(fā)揮的作用，旨在探索能夠提高體細胞核移植重構(gòu)胚囊胚生產(chǎn)效率的新途徑。結(jié)果顯示：試驗1中處理組3添加50nmol/L TSA作用于核移植重構(gòu)胚融合和激活階段（融合3h、激活6 h）可以有效抑制組蛋白去乙?；傅淖饔茫龠M組蛋白的乙?；?，從而達到明顯提高重構(gòu)胚發(fā)育的效果，50 nmol/L的TSA濃度處理后的體細胞核移植重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率（14．00%）要顯著高于處理組1

6、（0．5nmol/L，5．36%）、處理組2（5 nmol/L，6．12%）、處理組4（500 nmol/L，7．69%）和對照組（0 nmol/L，3．92%）（P<0．05）；試驗2中僅在融合階段添加TSA抑制組蛋白去乙酰化作用雖然在一定程度能夠提高重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率（5．56%），但與未添加TSA的處理組1（2．63%）相比差異不顯著（P>0．05），并不能顯著改善重構(gòu)胚的發(fā)育狀況；試驗3中在融合和激活階段均添加TSA的處理組3和

7、僅在激活階段添加TSA的處理組2的囊胚發(fā)育率（14．71% Vs12．12%）之間差異不顯著，但兩者與未添加TSA的對照組的囊胚發(fā)育率（6．45%）相比均差異顯著（P<0．05），可見TSA在激活階段對供體核染色質(zhì)組蛋白去乙?；饔玫囊种泼黠@提高了體細胞核移植重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育效率；試驗4中在融合階段添加TSA處理時間不變的前提下將TSA在激活階段的處理時間從6h延長至9h，雖然在一定程度上提高了重構(gòu)胚的囊胚發(fā)育率（15．56%），但與未

8、延長激活時間的處理組1（14，29%）相比囊胚率并沒有得到明顯的提高，兩者之間差異不顯著（P>0．05），說明延長激活階段TSA處理時間并不能進一步提高重構(gòu)胚的發(fā)育潛力。 2.昆白小鼠孤雌胚胎與雄性胚胎嵌合發(fā)育研究 本研究對小鼠早期胚胎進行性別鑒定，獲得雄性胚胎后與孤雌激活胚胎進行嵌合培養(yǎng)，其目的是為了建立一種新的異性胚胎嵌合培養(yǎng)模式，在便于通過分子生物學方法對胚胎不同來源進行性別檢測的基礎上，研究兩種不同類型胚胎細胞之

9、間在嵌合發(fā)育過程中的相互影響，為從嵌合發(fā)育胚胎中分析標記來源于孤雌胚胎的干細胞研究過程奠定基礎。本研究初步建立了構(gòu)建孤雌激活胚胎與雄性胚胎嵌合胚的方法與程序，對該過程中的幾個影響因素做了初步的探討。結(jié)果顯示：自主設計的兩對性別鑒定引物特異性較強，能夠分別擴增出公鼠所特有的250 bp Sry基因片段和公母小鼠共有的399 bp的ZFX基因片段：經(jīng)過優(yōu)化的雙重PCR體系能夠在取2個卵裂球作為PCR反應模板的前提下比較準確的判定小鼠早期胚胎

10、性別；在比較了各種去帶液的去帶效果及對胚胎的后續(xù)發(fā)育潛力的影響后發(fā)現(xiàn)，在0．5%鏈蛋白酶液中處理5 min后，胚胎能獲得較高的裸胚率（93．33%）和囊胚發(fā)育率（76．67％）；應用前面試驗建立的小鼠早期胚胎性別鑒定體系鑒定的有性生殖雄性8細胞胚胎與孤雌生殖8細胞胚胎在自制凹窩培養(yǎng)體系的胚胎聚合率（73．91%）與PHA微滴培養(yǎng)體系的胚胎聚合率（62．50%）相比差異顯著（P<0．05）。聚合胚胎在自制凹窩培養(yǎng)體系的囊胚發(fā)育率（47．8

11、2%）雖然高于PHA微滴培養(yǎng)體系（41．67%），但兩種體系之間差異不顯著（P>0．05），因此自制凹窩培養(yǎng)體系可以替代PHA微滴培養(yǎng)體系用于胚胎嵌合；通過免疫法對10枚嵌合囊胚內(nèi)細胞團進行了單細胞分離后有7枚嵌合囊胚的內(nèi)細胞團單細胞能夠在體外增殖。平均每個嵌合囊胚可得到1．40個類ES細胞集落，經(jīng)對其細胞進行性別鑒定檢測后發(fā)現(xiàn)，孤雌胚胎來源集落與雄性胚胎來源集落的比例為5：9。 3.利用小鼠MⅠ期卵母細胞獲取孤雌胚胎的研究

12、 依據(jù)利用細胞松弛素D（CD）能夠抑制小鼠MⅠ期卵母細胞排出第一極體，而保持染色體組的倍性，使染色體組類似于體細胞，通過適當?shù)募せ罘椒墒蛊浒l(fā)育為雜合二倍體孤雌囊胚，為獲得與卵母細胞供體組織相容性抗原更加匹配的孤雌生殖胚胎干細胞奠定基礎。本研究從激活方法和培養(yǎng)液的選擇兩個方面對利用CD處理獲取二倍體孤雌胚胎進行了初步研究，并且與MⅡ期卵母細胞孤雌胚的發(fā)育能力進行了比較。結(jié)果顯示：在含有5μg/ml濃度CD的mCZB培養(yǎng)基中作用3h，

13、能夠成功抑制第一極體的排出；經(jīng)過乙醇、SrCl2、A23187、電激活與A23187+6-DMAP五種激活方法激活后胚胎均能發(fā)育到囊胚階段；其中以A23187+6-DMAP激活效果最好（46．15%），激活后孤雌胚在mCZB培養(yǎng)液中發(fā)育到囊胚的比率也最高（19．23％）；應用前面試驗確定的最適激活方法處理后的MⅠ期孤雌胚胎分別在mCZB、KSOM、M16和mM16四種培養(yǎng)液中培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，以mM16培養(yǎng)液中的MⅠ期孤雌囊胚發(fā)育率最高（16

14、．67%）；應用A23187+6-DMAP分別對MⅠ和MⅡ期卵母細胞激活后培養(yǎng)于mM16培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)，MⅡ期卵母細胞的卵裂率顯著高于MⅠ期卵母細胞（65，88% Vs46．15%，p<0．05），但兩者的囊胚發(fā)育率之間差異不顯著（18．82% Vs17．58%，p>0．05）。 以上三個試驗，觀察探索了用于分離昆明小鼠治療性胚胎干細胞的囊胚生成的新途徑；綜合對不同來源囊胚生成途徑的關鍵問題進行了研究。研究結(jié)論如下： 1．

15、在昆白小鼠體細胞克隆胚胎的制作過程中，重構(gòu)胚于激活階段，在添加有50 nmol/LTSA的KSOM激活培養(yǎng)基中作用6h，可以在最小程度傷害重構(gòu)胚的情況下最大限度的實現(xiàn)對組蛋白去乙?；傅囊种?，促進組蛋白的乙?；?，可以明顯提高重構(gòu)胚發(fā)育至囊胚的效率。 2．雙引物雙重PCR法能夠成功的對小鼠早期胚胎進行性別鑒定；應用該方法選擇出的雄性胚胎與孤雌胚胎在自制凹窩培養(yǎng)體系中可成功發(fā)育至囊胚；同時應用這種性別鑒定方法，還成功的對嵌合囊胚內(nèi)細