靶向抑制GSK3β對增強(qiáng)Nrf2活性及保護(hù)足細(xì)胞的作用和機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性腎小球疾病是我國最常見的腎臟疾病類型。足細(xì)胞損傷在腎小球疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，是引起腎小球?yàn)V過障礙并導(dǎo)致蛋白尿的主要原因。保護(hù)足細(xì)胞是阻止腎小球疾病中腎功能惡化的主要措施。足細(xì)胞是高度分化的上皮細(xì)胞，其足突包繞著腎小球毛細(xì)血管，防止蛋白從血液漏入尿液中。足細(xì)胞還分泌至關(guān)重要的可溶性因子，維持其它腎小球細(xì)胞的動態(tài)平衡，并參與合成腎小球基底膜。此外，足細(xì)胞還參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)及膜再循環(huán)等高耗能的過程。這些過程由有氧呼吸產(chǎn)生的ATP供能

2、，因此細(xì)胞的氧代謝不可避免地產(chǎn)生有害的自由基和活性氧。在正常狀態(tài)下，氧化物的合成與清除是保持平衡的，然而，氧化物和抗氧化物的失衡將會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，造成足細(xì)胞的損傷和減少。
　　在自由基和活性氧的刺激下，哺乳類動物細(xì)胞會利用抗氧化應(yīng)激反應(yīng)維持氧化還原平衡和細(xì)胞的完整性。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nuclear factor erythroid2–related factor，Nrf2）在這種抗氧化反應(yīng)中起著極其重要的作用。Nrf

3、2屬于Cap-n-collar（CNC）調(diào)節(jié)蛋白家族，是一種含有亮氨酸拉鏈基本結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在抗氧化、解毒、抗炎中發(fā)揮重要作用。Nrf2已被證實(shí)是多器官系統(tǒng)的治療靶點(diǎn)，其中包括腎臟。
　　Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的、高度協(xié)調(diào)的過程，受多條信號通路調(diào)節(jié)。在非應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2僅存在于細(xì)胞質(zhì)中，并且與泛素E3連接酶的銜接蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like epichlorohydrin-asso

4、ciated protein1，Keap1）結(jié)合。Keap1導(dǎo)致Nrf2泛素化和蛋白降解。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激后，Nrf2與Keap1解離，轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)，并且轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)原件結(jié)合，啟動一系列抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，如血紅素氧合酶（heme oxygenase1，HO-1）。在眾多的非Keap1依賴性Nrf2調(diào)控途徑中，GSK3β是一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。GSK3β是一種廣泛表達(dá)、持續(xù)活化的脯氨酸定向絲氨酸/蘇氨酸激酶，在多種病理生理過程中

5、發(fā)揮作用。有研究表明：在老齡化、2型糖尿病、神經(jīng)性病變、肝臟疾病等多種疾病中GSK3β均可調(diào)控Nrf2。但是在腎小球疾病中，特別是足細(xì)胞疾病中，GSK3β是否能調(diào)控Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)？此前還未見報(bào)道。我們分別在阿霉素腎病小鼠模型、腎毒血清性腎炎小鼠模型、原代足細(xì)胞中研究了GSK3β對Nrf2的調(diào)控作用。
　　第一部阿霉素腎病小鼠中，GSK3β基因敲除和SB216763對Nrf2活性及足細(xì)胞損傷的影響
　　目的：

6、　　在阿霉素腎病小鼠模型中，檢測條件性GSK3β基因敲除以及SB216763系統(tǒng)性給藥后，是否會對足細(xì)胞Nrf2抗氧化反應(yīng)有調(diào)控作用，以及是否對足細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。
　　方法：
　　1.利用Cre/loxP技術(shù)構(gòu)建條件性GSK3β基因敲除小鼠。RT-PCR、Real time PCR及免疫組化染色驗(yàn)證足細(xì)胞中GSK3β敲除是否成功。
　　2.通過尾靜脈注射阿霉素，建立阿霉素腎病小鼠模型，隨機(jī)分為 Con組、KO組、Co

7、n+ADR組、KO+ADR組、KO+ADR+Trig組。將各組小鼠尿液進(jìn)行凝膠電泳，并用考馬斯亮藍(lán)染色；檢測各組小鼠尿白蛋白/肌酐的值。PAS染色及電鏡觀察各組小鼠腎臟病理的改變。
　　3.免疫熒光檢測Nrf2與WT1的共定位、Synaptopodin與Desmin的共定位，以及Podocin的表達(dá)量。免疫組化檢測腎小球中Nrf2的表達(dá)及分布。
　　4.Westernblot檢測Nrf2、HO-1、Synaptopodin、

8、Podocin、WT1的蛋白表達(dá)水平。
　　5.小鼠尾靜脈注射阿霉素及 SB216763，隨機(jī)分為 Ctrl組、ADR組、ADR+SB-L組、ADR+SB組、ADR+SB+Trig組。檢測各組小鼠尿白蛋白/肌酐的值。PAS染色及電鏡觀察各組小鼠腎臟病理的改變。
　　6.免疫熒光檢測Nrf2與WT1的共定位、TUNEL陽性細(xì)胞與WT1陽性細(xì)胞共定位。
　　7.Westernblot檢測Nrf2、HO-1、p-GSK3β、

9、Podocin、WT1、Cleaved caspase3的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　1.KO+ADR組小鼠的尿ACR值明顯低于ADR組和KO+ADR+Trig組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.KO+ADR組小鼠的腎小球損傷指數(shù)明顯小于 Con+ADR組和KO+ADR+Trig組（ P＜0.05）；KO+ADR組小鼠的足突平均寬度也明顯小于Con+ADR組和KO+ADR+Trig組（P＜0.05）；KO

10、+ADR組小鼠平均每個(gè)腎小球WT-1陽性細(xì)胞的數(shù)目明顯多于Con+ADR組和KO+ADR+Trig組（P＜0.05）。
　　3.KO+ADR組小鼠腎小球中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平明顯高于Con+ADR組和KO+ADR+Trig組（P＜0.05）。
　　4.KO+ADR組出現(xiàn)Nrf2核聚集的足細(xì)胞數(shù)目明顯多于Con+ADR組（P＜0.05）。然而，KO+ADR+Trig組小鼠足細(xì)胞沒有Nrf2核聚集的現(xiàn)象。
　　5

11、.KO+ADR組小鼠腎小球中Synaptopodin、Podocin的表達(dá)水平高于Con+ADR組小鼠，Desmin的表達(dá)水平低于Con+ADR組小鼠。然而，KO+ADR+Trig組小鼠腎小球中Synaptopodin、Podocin的表達(dá)水平低于KO+ADR組小鼠，Desmin的表達(dá)水平高于Con+KO組小鼠。（P＜0.05）
　　6.ADR+SB組小鼠的尿ACR值明顯低于ADR組和ADR+SB+Trig組（P＜0.05）。且A

12、DR+SB組小鼠的尿ACR值明顯低于ADR+SB-L組（P＜0.05）。
　　7.ADR+SB組小鼠的腎小球損傷指數(shù)明顯小于ADR組和ADR+SB+Trig組（P＜0.05）；ADR+SB組小鼠的足突平均寬度也明顯小于ADR組和ADR+SB+Trig組（P＜0.05）；ADR+SB組小鼠平均每個(gè)腎小球中WT-1與TUNEL共表達(dá)的細(xì)胞數(shù)目明顯少于ADR組和ADR+SB+Trig組（P＜0.05）。
　　8.ADR+SB組小鼠

13、腎小球中Nrf2、HO-1、Podocin、WT-1蛋白表達(dá)水平明顯高于ADR組（P＜0.05）。
　　9.ADR+SB組出現(xiàn)Nrf2核聚集的足細(xì)胞數(shù)目明顯多于ADR組（P＜0.05）。然而，ADR+SB+Trig組小鼠足細(xì)胞沒有Nrf2核聚集的現(xiàn)象。
　　結(jié)論
　　1.條件性GSK3β基因敲除可降低阿霉素腎病小鼠的蛋白尿，減輕腎小球損傷。
　　2.在阿霉素腎病小鼠中，GSK3β基因敲除是通過調(diào)控Nrf2的抗氧化

14、反應(yīng)而發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用。
　　3.通過SB216763抑制GSK3β，可以降低阿霉素腎病小鼠的蛋白尿，減輕腎小球損傷。
　　4.在阿霉素腎病小鼠中，SB216763是通過調(diào)控Nrf2的抗氧化反應(yīng)而發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用。
　　第二部分腎毒血清腎炎小鼠中，GSK3β基因敲除和SB216763對Nrf2活性及足細(xì)胞損傷的影響
　　目的：
　　在腎毒血清腎炎小鼠模型中，檢測條件性 GSK3β基因敲除以及 SB216

15、763系統(tǒng)性給藥后，是否會對足細(xì)胞Nrf2抗氧化反應(yīng)有調(diào)控作用，以及是否對足細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。
　　方法
　　1.利用Cre/loxP技術(shù)構(gòu)建條件性GSK3β基因敲除小鼠。RT-PCR、Real time PCR及免疫組化染色驗(yàn)證足細(xì)胞中GSK3β敲除是否成功。
　　2.通過尾靜脈注射腎毒血清，建立腎毒血清腎炎小鼠模型，隨機(jī)分為Con+IgG組、KO+IgG組、Con+NTS組、KO+NTS組、KO+NTS+Trig組

16、。取各組小鼠尿凝膠電泳，并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色；檢測各組小鼠尿白蛋白/肌酐的值。電鏡觀察各組小鼠腎臟病理的改變。
　　3.免疫熒光檢測Nrf2與WT1的共定位。
　　4. Westernblot檢測Nrf2、HO-1、Synaptopodin的蛋白表達(dá)水平。
　　5.尾靜脈注射阿霉素及 SB216763，隨機(jī)分為 IgG組、NTS+Vehicle組、NTS+SB組。檢測各組小鼠尿白蛋白/肌酐的值.。PAS染色及電鏡觀察各

17、組小鼠腎臟病理的改變。
　　6.免疫熒光檢測Nrf2與WT1的共定位。
　　7.Westernblot檢測Nrf2、HO-1、p-GSK3β、Synaptopodin的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.KO+NTS組小鼠的尿ACR值明顯低于Con+NTS組和KO+NTS+Trig組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.KO+NTS組小鼠的足突平均寬度也明顯小于 Con+NTS組和KO+NTS+Tr

18、ig組（P＜0.05）；KO+NTS組小鼠平均每個(gè)腎小球WT-1陽性細(xì)胞的數(shù)目明顯高于Con+NTS組和KO+NTS+Trig組。
　　3.KO+NTS組小鼠腎小球中Nrf2、HO-1、Synaptopodin蛋白表達(dá)水平明顯高于Con+NTS組和KO+NTS+Trig組（P＜0.05）。
　　4.KO+NTS組出現(xiàn) Nrf2核聚集的足細(xì)胞數(shù)目明顯多于 Con+NTS組（P＜0.05）。然而，KO+NTS+Trig組小鼠足細(xì)

19、胞沒有Nrf2核聚集的現(xiàn)象。
　　5.NTS+SB組小鼠的尿ACR值明顯低于NTS+Vehicle組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　6.NTS+SB組小鼠的腎小球損傷指數(shù)明顯小于NTS+Vehicle組（P＜0.05）；NTS+SB組小鼠的足突平均寬度也明顯小于NTS+Vehicle組（P＜0.05）；NTS+SB組小鼠平均每個(gè)腎小球中WT-1陽性細(xì)胞的數(shù)目明顯高于NTS+Vehicle組（P＜0.05）。

20、　　7. NTS+SB組小鼠腎小球中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平明顯高于NTS+Vehicle組（P＜0.05）
　　8.NTS+SB組出現(xiàn)Nrf2核聚集的足細(xì)胞數(shù)目明顯多于NTS+Vehicle組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.足細(xì)胞條件性 GSK3β基因敲除可以降低腎毒血清腎炎小鼠的蛋白尿，減輕小鼠的腎小球損傷。
　　2.在腎毒血清腎炎小鼠中，GSK3β基因敲除是通過調(diào)控Nrf2的抗氧化反應(yīng)而起到足

21、細(xì)胞保護(hù)作用。
　　3.通過SB216763抑制GSK3β，可以降低腎毒血清腎炎小鼠的蛋白尿，減輕小鼠的腎小球損傷。
　　4.SB216763可增強(qiáng)Nrf2抗氧化應(yīng)激能力。
　　第三部分原代足細(xì)胞中，靶向抑制 GSK3β對 Nrf2活性及細(xì)胞保護(hù)作用的影響
　　目的：
　　用SB216763處理阿霉素?fù)p傷的原代足細(xì)胞，或?qū)⒓?xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒KD使GSK3β失活，檢測足細(xì)胞Nrf2活性有無變化，以及是否減輕足細(xì)胞

22、凋亡及細(xì)胞骨架破壞。
　　方法
　　1.阿霉素處理原代培養(yǎng)的足細(xì)胞，將細(xì)胞隨機(jī)分為5組：Con組、ADR組、ADR+tBHQ組、ADR+SB組、ADR+SB+Trig組。
　　2.通過Western blot檢測ADR組、ADR+SB組中Nrf2、HO-1、pGSK3β、Cleaved caspase3的蛋白表達(dá)水平。
　　3.免疫熒光檢測各組細(xì)胞Nrf2、TUNEL、F-actin的表達(dá)情況。
　　4.原

23、代足細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染入空載體（EV）、WT質(zhì)粒、GSK3β失活（KD）質(zhì)粒、GSK3βS9位點(diǎn)持續(xù)激活（S9A）質(zhì)粒。將細(xì)胞分為5組：EV組、WT組、KD組、S9A組、S9A+SB組。
　　5.Westernblot檢測各組細(xì)胞Nrf2、HO-1、Cleaved caspase3的蛋白表達(dá)水平。
　　6.免疫熒光檢測各組細(xì)胞Nrf2、F-actin的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.ADR+SB組Nrf2、HO-1、p

24、GSK3β的蛋白表達(dá)水平高于ADR組（P＜0.05）；Cleaved caspase3的蛋白表達(dá)水平低于ADR組（P＜0.05）
　　2.ADR+SB組細(xì)胞凋亡的數(shù)目小于ADR組和ADR+SB+Trig組（P＜0.05）；ADR+SB組Nrf2核聚集數(shù)目大于ADR組和 ADR+SB+Trig組（P＜0.05）；ADR+SB組細(xì)胞骨架的完整性高于ADR組和ADR+SB+Trig組。
　　3.KD組Nrf2、HO-1蛋白水平高于

25、WT組，Cleaved caspase3的蛋白表達(dá)水平低于WT組；S9A組Nrf2、HO-1蛋白水平低于WT組，Cleaved caspase3的蛋白水平高于WT組。S9A+SB216763組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平高于S9A組，Cleaved caspase3的蛋白表達(dá)水平低于S9A組（P＜0.05）。
　　4. KD組Nrf2核聚集數(shù)目大于其余各組（P＜0.05）；KD組細(xì)胞骨架的完整性高于其余各組。S9A+SB2167

26、63組Nrf2核轉(zhuǎn)聚集目大于S9A組（P＜0.05）；S9A+SB216763組細(xì)胞骨架的完整性高于S9A組。
　　結(jié)論：
　　1.在阿霉素?fù)p傷后的原代足細(xì)胞中，SB216763可以提高Nrf2介導(dǎo)的抗氧化能力。
　　2.SB216763可以增加Nrf2的核聚集、減輕足細(xì)胞凋亡、保護(hù)細(xì)胞骨架的完整性。
　　3.GSK3β失活會提高 Nrf2介導(dǎo)的抗氧化能力；GSK3β持續(xù)激活會抑制Nrf2介導(dǎo)的抗氧化能力。