GSK3抑制劑對水牛類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)效果的影響.pdf

1、本研究擬通過添加GSK3特異性抑制劑BIO和CHIR99021，探討Wnt/β-catenin信號通路在水牛類胚胎干細(xì)胞（水牛類ES細(xì)胞）增殖與分化過程中的作用及其調(diào)控的分子機(jī)制，進(jìn)而優(yōu)化水牛類ES細(xì)胞的培養(yǎng)體系。
　　 本研究分為以下四個(gè)試驗(yàn)。
　　 試驗(yàn)一探討了GSK3抑制劑對水牛類ES細(xì)胞原始克隆形成的影響。在培養(yǎng)液中添加0.5μg/mL BIO或5mmol/L CHIR99021對水牛囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)貼壁率無顯著影

2、響（91.18％和92.98％ vs94.59％，P＞0.05），但添加CHIR99021的原始克隆形成率(77.71％)顯著高于對照組(55.41％，P＜0.05)，添加BIO的原始克隆形成率(72.06％)與對照組無顯著差異(P＞0.05)。
　　 試驗(yàn)二比較了GSK3抑制劑對水牛類ES細(xì)胞原始克隆增殖及傳代效果的影響。通過水牛類ES細(xì)胞原始克隆增殖率的Brdu免疫熒光檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHIR99021組第1、3、4、5天顯著

3、高于對照組（P＜0.05），而BIO組第1天顯著高于對照組(P＜0.05)，其它天數(shù)差異不顯著(P＞0.05)。水牛類ES細(xì)胞原始克隆平均直徑測量結(jié)果顯示:CHIR99021組顯著大于對照組(203.41μm vs128.01μm，P＜0.05)，BIO組（166.64μm）大于對照組，但差異不顯著(P＞0.05)。同時(shí)，與增殖相關(guān)基因PCNA表達(dá)的qRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BIO和CHIR99021組的PCNA mRNA相對表達(dá)量顯

4、著高于對照組(P＜0.05)。此外，對BIO處理組、CHIR99021處理組、對照組的克隆分別進(jìn)行傳代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn):對照組和BIO組目前傳至10代、10代，而CHIR99021組目前傳至11代。
　　 試驗(yàn)三研究了GSK3抑制劑對水牛類ES細(xì)胞多能性標(biāo)志基因表達(dá)的影響。Oct4、Sox2、Nanog mRNA相對表達(dá)量的qRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CHIR99021組的Oct4、Sox2顯著高于對照組(P＜0.05)，Nanog與對

5、照組差異不顯著(P＞0.05);BIO組Oct4顯著高于對照組(P＜0.05)，Sox2和Nanog顯著低于對照組(P＜0.05)。
　　 試驗(yàn)四探討了GSK3抑制劑對水牛類ES細(xì)胞中Wnt信號通路的影響。免疫熒光技術(shù)檢測Wnt信號通路的下游效應(yīng)器β-Catenin蛋白的相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，BIO和CHIR99021組顯著高于對照組(P＜0.05)。QRT-PCR檢測Wnt信號通路的下游靶基因c-Myc mRNA的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，BIO和