嗜鐵鉤端螺旋菌Lepptospirillurm ferriphilumUBK03抗鎳操縱子表達調(diào)控機理研究.pdf

1、本實驗室從嗜鐵鉤端螺旋菌UBK03中克隆到一個與鎳抗性相關的操縱子ncrABCY,該操縱子含4個結構基因ncrA,ncrB,ncrC及ncrY。NcrA為該抗性系統(tǒng)的核心組件,與輔助蛋白NcrC組裝成跨膜通道,NcrY對抗鎳系統(tǒng)起負作用,NcrB作為阻遏蛋白能夠調(diào)節(jié)ncrA基因的表達。本論文研究是以此操縱子為對象,開展了其表達調(diào)控機理的研究。
　　 將ncrABCY轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109得到克隆子NR21。通過比較未經(jīng)Ni2+誘

2、導及經(jīng)過誘導的NR21菌株在含Ni2+LB培養(yǎng)基中的生長情況,發(fā)現(xiàn)未經(jīng)誘導的NR21菌株生長比經(jīng)過誘導的NR21菌株要滯后2小時,說明ncrABCY受Ni2+誘導表達。RT-PCR實驗對基因轉(zhuǎn)錄分析,發(fā)現(xiàn)Ni2+能夠增強ncrA,ncrB,ncrC的轉(zhuǎn)錄水平,熒光定量PCR結果顯示在含Ni2+LB培養(yǎng)基中生長的NR21菌株ncrA的轉(zhuǎn)錄量要比在普通LB培養(yǎng)基中高10倍。
　　 利用S1 mapping實驗確定了ncrA基因的轉(zhuǎn)錄

3、起始位點。對ncrA啟動子pncrA序列分析,在轉(zhuǎn)錄起始位點上發(fā)現(xiàn)了一段富含GC的反向重復序列p1p17,并且通過凝膠阻滯實驗和DNaseⅠ足跡實驗,確定NcrB蛋白能夠與pncrA上的反向重復序列p1p17特異結合。
　　 細菌單雜交實驗進一步在菌株體內(nèi)檢測了NcrB與pncrA的相互結合作用。并且還發(fā)現(xiàn),在細菌單雜交正篩選培養(yǎng)基中加入1mM Ni2+,NcrB與pncrB的結合作用能夠被解除。由此可知,NcrB是一個受鎳調(diào)控

4、的金屬調(diào)節(jié)蛋白。此外通過構建一系列pncrA截短片段,發(fā)現(xiàn)只有完全包含p1p17的截短片段才能夠與NcrB結合。這也說明NcrB能通過反向重復序列直接結合在pncrA上。在不結合Ni2+時,NcrB通過與p1p17結合,阻止RNA聚合酶與啟動子的結合,抑制了ncrA的表達。
　　 在ncrABCY操縱子上的另外兩個啟動子pncrB和pncrY中都包含了與p1p17相似但不完整的反向重復序列,體內(nèi)實驗表明它們都不能與NcrB結合。