EPHX2 rs751141基因多態(tài)性與糖尿病血管并發(fā)癥相關(guān)性研究及其機制探討.pdf

1、多項流行病學調(diào)查顯示，2型糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種復(fù)雜的代謝紊亂疾病，長期高血糖會導(dǎo)致機體多器官受累并出現(xiàn)較嚴重的并發(fā)癥。目前認為DM血管并發(fā)癥中糖尿病相關(guān)腎病(diabetic kidney disease，DKD)以及缺血性腦卒中的發(fā)生與遺傳等因素密切相關(guān)。近年來，可溶性環(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase，sEH)在腎臟疾病尤其是DKD以及缺血性腦卒中的發(fā)病中所起的作用

2、逐漸被重視，sEH抑制劑的研究以及該基因敲除有可能成為DKD及缺血性腦卒中治療的新靶點。編碼sEH的EPHX2基因rs751141多態(tài)性(R287Q)能影響sEH酶活性并且與多種臨床疾病有關(guān)，其與DKD及糖尿病缺血性腦卒中的相關(guān)性目前尚有待于進一步研究。
　　研究目的:
　　1.探討EPHX2rs751141基因多態(tài)性中A等位基因是否是DM血管并發(fā)癥DKD和缺血性腦卒中的保護因素。
　　2.研究EPHX2rs75114

3、1基因多態(tài)性A等位基因與sEH水解酶活性的關(guān)系及其參與DKD的分子機制。
　　研究方法:
　　1.EPHX2rs751141基因多態(tài)性與2型DM血管并發(fā)癥相關(guān)性研究:
　　1)EPHX2rs751141基因多態(tài)性與DKD的相關(guān)性研究:870例2型DM患者均為中日友好醫(yī)院2015年2月至2016年6月住院患者，其中DKD患者406例（男性258例、女性148例），對照組糖尿病不伴相關(guān)腎病(Non-diabetic kid

4、ney disease，Non-DKD)患者464例（男性271例、女性193例）。提取患者外周血DNA并用熒光探針法進行SNP檢測。采用卡方檢驗方法分析基因型頻率、等位基因頻率以及Hardy-Weinberg平衡。統(tǒng)計學效力分析采用Quanto software version1.2.4軟件，所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理，當p＜0.05，認為有統(tǒng)計學差異。
　　2)EPHX2rs751141基因多態(tài)性與DM伴缺血

5、性腦卒中相關(guān)性研究:626例2型DM患者均為中日友好醫(yī)院2015年2月至2016年6月住院患者。其中DM伴缺血性腦卒中患者236例（男性127例、女性109例），對照組DM不伴缺血性腦卒中患者390例（男性241例、女性149例）。檢測方法、數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析同1）。
　　2.EPHX2多態(tài)性與sEH水解酶活性的關(guān)系及其參與DKD分子機制研究:
　　1)不同突變類型sEH重組質(zhì)粒構(gòu)建及其與sEH水解酶活性的關(guān)系:以人的cDN

6、A為模板，根據(jù)GeneBank中人EPHX2mRNA CDS序列設(shè)計引物，利用p-UCT DNA連接試劑盒及點突變技術(shù)在野生型基礎(chǔ)上誘導(dǎo)點突變，共構(gòu)建4種單點突變和3種雙點突變重組質(zhì)粒，并將其亞克隆至真核表達載體pcDNA3.1/V5-His-A。以Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將8種不同類型的sEH重組質(zhì)粒:EPHX2/pcDNA3.1/V5-His(WT)EPHX2/R287Q/pcDNA3.1/V5-His(R287Q

7、)、EPHX2/R287Q/R103C/pcDNA3.1/V5-His(R287Q+R103C)EPHX2/C154T/pcDNA3.1/V5-His(C154T)、PHX2/K55R/pcDNA3.1/V5-His(K55R)、EPHX2/R103C/pcDNA3.1/V5-His(R103C)、EPHX2/K55R/R103C/pcDNA3.1/V5-His(K55R+R103C)、EPHX2/K55R/C154T/pcDNA3.1

8、/V5-His(K55R+C154T)及pcDNA3.1/V5-His-A空載體(negtive control，NC)轉(zhuǎn)染至HK2細胞，同時轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標簽的重組質(zhì)粒，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，Western Blot檢測融合蛋白的表達。將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK2細胞，并將其分為兩組，其中一組細胞培養(yǎng)液中補充足量的11，12-EET，另外一組在補充11，12-EET的同時

9、加入sEH抑制劑TPPU。ELISA方法檢測各組細胞培養(yǎng)液中的11，12-DHET含量，采用t檢驗比較不同類型sEH重組質(zhì)粒的水解活性是否存在差異以及TPPU對水解酶活性的影響。
　　2)R287Q突變型重組質(zhì)粒參與DKD分子機制研究:將成功構(gòu)建的WT組、R287Q突變型組和NC組重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HK2細胞，各分為兩組，其中一組轉(zhuǎn)染48h后收獲細胞培養(yǎng)上清、RNA和蛋白，另外一組轉(zhuǎn)染24h后給予11，12-EET共同培養(yǎng)后收獲細

10、胞培養(yǎng)上清、RNA和蛋白，檢測NO、IL-17A以及IL-1等炎癥因子水平、RT-PCR檢測eNOS、IL-17A、IL-6和IL-1β等mRNA表達水平及Western blot方法檢測PI3K/AKT信號通路蛋白表達。
　　研究結(jié)果:
　　1.EPHX2rs751141基因多態(tài)性與2型DM血管并發(fā)癥相關(guān)性研究:
　　1)EPHX2rs751141基因多態(tài)性與DKD相關(guān)性研究結(jié)果:Non-DKD組rs751141A等

11、位基因頻率明顯高于DKD組(p＜0.01)。校正DKD相關(guān)風險因素后，在加性和隱性遺傳模型下A等位基因攜帶者具有較低的DKD患病風險(OR=0.68，95％CI=0.52-0.88，p＜0.01;OR=0.28，95％CI=0.14-0.60，p＜0.01)。相關(guān)結(jié)果表明在高同型半胱氨酸時，在校正DKD相關(guān)風險因素后，三種遺傳模型A等位基因攜帶者均具有比較低的DKD患病風險(p＜0.01，p＜0.05和p＜0.05)。
　　2)E

12、PHX2rs751141基因多態(tài)性與DM缺血性腦卒中相關(guān)性研究結(jié)果:DM不伴缺血性腦卒中組EPHX2rs751141A等位基因頻率明顯高于DM伴缺血性腦卒中組(p＜0.05)。校正相關(guān)風險因素后，在加性和顯性遺傳模型下，A等位基因攜帶者具有較低的缺血性腦卒中患病風險(OR=0.72，95％CI=0.55-0.97，p＜0.05;OR=0.67，95％CI=0.48-0.95,p＜0.05)。
　　2.EPHX2rs751141多態(tài)

13、性A等位基因與sEH水解酶活性的關(guān)系及其參與DKD的分子機制研究:
　　1)不同類型sEH重組質(zhì)粒與sEH水解酶活性的關(guān)系:成功構(gòu)建了1種野生型WT和7種突變型重組質(zhì)粒(R287Q、R287Q+R103C、C154T、K55R、R103C、K55R+R103C、K55R+C154T)，并建立HK-2高表達系統(tǒng)。其中，R287Q重組質(zhì)粒組11，12-DHET水平明顯低于WT組(p＜0.01);C154T重組質(zhì)粒組明顯高于WT組(p＜

14、0.05)。細胞培養(yǎng)液中加入11，12-EET的同時給予TPPU，可顯著下調(diào)11，12-DHET含量至基礎(chǔ)水平。
　　2)炎癥因子及信號通路檢測:突變型R287Q組細胞上清NO水平、IL-17A水平以及IL-1β水平明顯低于WT組(p＜0.05)。相對于單純WT組，加入11，12-EET共同培養(yǎng)的WT組炎癥因子水平降低，但仍高于加入11，12-EET突變型R287Q組。RT-PCR結(jié)果也發(fā)現(xiàn)R287Q組中在eNOS、IL-17A、

15、IL-6和IL-1β等的mRNA表達水平低于WT組，相對于單純WT組，加入11，12-EET共同培養(yǎng)的WT組炎癥因子mRNA表達水平降低，但仍高于加入11，12-EET突變型R287Q組。采用Western blot方法檢測NC組、WT組和R287Q組蛋白發(fā)現(xiàn)R287Q組可以通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路減輕DKD炎癥。
　　研究結(jié)論:
　　1.EPHX2rs751141多態(tài)性中A等位基因?qū)M血管并發(fā)癥DKD和缺血性腦卒