EPO與糖尿病微血管并發(fā)癥的遺傳相關(guān)性及其功能的研究.pdf

1、目的： 視網(wǎng)膜并發(fā)癥和腎臟并發(fā)癥是糖尿病微血管并發(fā)癥的代表，也是發(fā)病最多最嚴(yán)重的糖尿病微血管并發(fā)癥。糖尿病患者同患視網(wǎng)膜和腎臟并發(fā)癥比率很高，并且有家族聚集性，提示遺傳因素增加了糖尿病微血管并發(fā)癥的易感性，但是相關(guān)基因和遺傳變異所知甚少。本研究旨在尋找糖尿病微血管并發(fā)癥遺傳傾向性的易感基因。 方法： 1．從包括促血紅素生成因子(Erythpotein，EPO)等幾個(gè)重要的血管生成因子中挑選11個(gè)基因的19個(gè)標(biāo)簽或

2、者具有潛在的功能改變的單核苷酸多態(tài)性(SNP)對樣本進(jìn)行了基因分型研究。樣本來自美國三個(gè)糖尿病人群(cohorts)伴有或不伴有增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變和終末期糖尿病腎病共計(jì)2672人。 2．進(jìn)一步用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)計(jì)算模例分型，熒光報(bào)告基因表達(dá)強(qiáng)度分析的方法，檢測與糖尿病微血管病變相關(guān)聯(lián)基因啟動子區(qū)域的等位基因的活性，找出與糖尿病微血管并發(fā)癥關(guān)聯(lián)的等位基因型。 3．用實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄PCR，ELISA，免疫熒光組織化學(xué)分析以及

3、制備糖尿病腎病鼠和氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變鼠模型等方法，進(jìn)一步驗(yàn)證等位基因與糖尿病微血管并發(fā)癥的關(guān)系。 4．用外源性增加EPO的方法，即角膜內(nèi)注射EPO觀察是否引起新生血管，來探討EPO的促血管增生的功能。 結(jié)果： 1．猶他Ⅱ型糖尿病人群基因分型結(jié)果中，位于EPO基因啟動子區(qū)域的SNP rs1617640與微血管并發(fā)癥具有關(guān)聯(lián)性(P=-1.91×10-3，致病T等位基因型在病人中的比率為63.10％，對照組中為54.1

4、8％)，波士頓Ⅰ型糖尿病人群中P=-2.1×10-2，GoKindⅠ型糖尿病人群P=-2.66×10-8。 2．用在線軟件MatInspector對EPO基因的上游SNP rs1617640附近進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)計(jì)算模例分型以及熒光報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度分析，結(jié)果表明T等位基因型有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其啟動子活性是G等位基因型的25倍(P=4.7×10-29)。 3．用ELISA檢測TT等位基因型純合子個(gè)體的眼玻璃體中的EPO

5、蛋白濃度是GG純合子的7.5倍，EPOmRNA在糖尿病人群TT等位基因型個(gè)體的淋巴細(xì)胞濃度也高于GG等位基因型(P=3.3×10-2)。人視網(wǎng)膜免疫組織化學(xué)分析結(jié)果EPO在TT基因型的個(gè)體表達(dá)強(qiáng)于GG基因型個(gè)體； 4．用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR測定糖尿病鼠的腎臟和OIR鼠的視網(wǎng)膜的EPO基因的mRNA水平是對照組的3倍(腎病組P=-0.0022，視網(wǎng)膜病變組P=1.1×10-7)。5．角膜內(nèi)注射EPO(6例中5例)誘發(fā)角膜新生血管，

6、對照組(6例)無陽性結(jié)果。EPO及其受體EPOR在正常角膜上皮細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，在堿燒傷誘導(dǎo)的角膜新生血管上可見表達(dá)。 結(jié)論： EPO基因與糖尿病微血管并發(fā)癥的遺傳易感性有關(guān)，其啟動子區(qū)域rs1617640SNP的基因型T是與微血管并發(fā)癥易感性有關(guān)的等位基因。本研究從基因?qū)W角度提出了一個(gè)新的糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)理，提示糖尿病病人在應(yīng)用重組EPO藥物時(shí)，應(yīng)慎重考慮具有糖尿病微血管并發(fā)癥易感基因型的病人用藥