5-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)羅丹寧抗腦缺血再灌注損傷作用及機制研究.pdf

1、腦卒中是目前全球第二大致死性疾病且致殘率最高，給患者和家庭帶來沉重的負擔。溶栓療法一直是急性血管梗死的速效治療方法，但溶栓后所致的腦缺血再灌注損傷與腦缺血疾病的預后和后遺癥的形成和治療有密切關(guān)系，該問題也日趨受到重視?，F(xiàn)有抗腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護藥物種類較少，亟需尋找更為有效的治療藥物。
　　5-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)羅丹寧(RD-1)，是在羅丹寧的化學結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進一步修飾合成的新型化合物，已經(jīng)獲得國家發(fā)明專利授權(quán)。

2、前期的實驗表明，RD-1能顯著對抗MPTP誘導的多巴胺能神經(jīng)元損傷毒性，可能通過改善線粒體功能障礙發(fā)揮抗帕金森病的腦保護作用。而線粒體功能障礙是多種神經(jīng)性疾病共同的病理生理基礎(chǔ)，也是腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)元細胞死亡的原因之一。因此推測是否RD-1也可能通過改善腦缺血再灌注損傷所致的線粒體功能障礙，從而發(fā)揮抗腦缺血損傷的神經(jīng)保護作用。本研究的目的即:采用氧糖剝奪后復灌(OGD/R)模型模擬體外腦缺血再灌注損傷，進而采用大鼠大腦中動脈梗阻(

3、MCAO)2h后復灌造成體內(nèi)急性腦缺血再灌注模型，觀察RD-1對抗腦缺血再灌注損傷的保護作用，并從組織水平、細胞水平、分子水平等多層面探討RD-1的作用機制，為其臨床應用轉(zhuǎn)化提供理論基礎(chǔ)。
　　本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 5-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)羅丹寧抗腦缺血再灌注損傷藥效學研究
　　1.在大鼠原代皮層神經(jīng)元細胞上建立OGD/R模型，1、5及10μM的RD-1作用48h后可以顯著對抗Na2

4、S2O4誘導的細胞損傷，提高細胞活性(P＜0.05)。
　　2.建立大鼠MCAO模型并2h后復灌，連續(xù)給藥14d后確認藥效。RD-1可顯著降低大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀評分(P＜0.05)，顯著縮短大鼠去除兩側(cè)前肢貼紙的時間(P＜0.05)，顯著改善MCAO損傷所致的大鼠精神狀態(tài)異常(P＜0.05)。在平衡桿實驗中一定程度上縮短大鼠過桿總時間，但未有統(tǒng)計學差異。MCAO損傷對于大鼠的自發(fā)運動能力及學習記憶能力并無顯著影響。
　　3

5、.HE染色結(jié)果顯示，大鼠大腦在MCAO損傷14d后腦梗死體積顯著增加(P＜0.01);各給藥組經(jīng)過14d治療后能夠明顯降低腦梗死體積（P＜0.05）。
　　4.對MCAO大鼠大腦損傷側(cè)皮層NeuN陽性細胞計數(shù)進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，RD-1可顯著抑制MCAO大鼠的損傷側(cè)大腦皮層前肢感覺區(qū)神經(jīng)元的丟失(P＜0.01)。各組之間正常側(cè)大腦皮層前肢感覺區(qū)單位面積內(nèi)NeuN陽性神經(jīng)元數(shù)量無明顯變化。
　　第二部分 5-(4-羥基-3-甲

6、氧基苯亞甲基)羅丹寧抗腦缺血再灌注損傷作用機制研究
　　1.OGD/R損傷可誘導大鼠原代皮層神經(jīng)元內(nèi)活性氧大量生成(P＜0.001)，線粒體膜電位顯著下降(P＜0.001)，同時細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的鈣超載現(xiàn)象(P＜0.01);而RD-1可明顯減輕OGD/R造成的線粒體損傷，顯著抑制活性氧的過量生成(P＜0.001)，穩(wěn)定線粒體膜電位(P＜0.001)，并減輕細胞內(nèi)鈣超載（P＜0.05）。
　　2.OGD/R損傷的大鼠原代皮層神經(jīng)

7、元中線粒體分裂蛋白DRP1無明顯變化，但線粒體融合蛋白OPA1的表達顯著下調(diào)(P＜0.01)，RD-1給藥可顯著提高OPA1的表達(P＜0.05)。
　　3.對大鼠損傷側(cè)皮層組織蛋白水平的檢測結(jié)果顯示，MCAO損傷14d后線粒體分裂蛋白DRP1、線粒體融合蛋白OPA1和MFN2均顯著下調(diào)(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)，而RD-1各給藥組可顯著增加上述3個蛋白的表達水平，從而對抗MCAO損傷所致的線粒體分裂及融合障礙

8、。
　　4.MCAO損傷14d后大鼠損傷側(cè)皮層組織中線粒體自噬標記蛋白Beclin1的表達明顯降低(P＜0.001)，且LC3-Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)變比例降低(P＜0.001);RD-1可通過激活PINK1/Parkin通路和Nix通路，促進神經(jīng)元內(nèi)線粒體自噬過程。
　　5.線粒體軸突轉(zhuǎn)運實驗結(jié)果顯示，OGD/R損傷引起線粒體軸突轉(zhuǎn)運障礙，表現(xiàn)為順向轉(zhuǎn)運減慢，逆向轉(zhuǎn)運加快(P＜0.001);RD-1可顯著加快線粒體的順向轉(zhuǎn)運(P＜0

9、.001)，減慢逆向轉(zhuǎn)運(P＜0.001)。同時體內(nèi)外western blot實驗均證明RD-1可改善損傷后線粒體順向轉(zhuǎn)運單位復合物中驅(qū)動蛋白KIF1B和受體蛋白Miro2的表達(P＜0.05，P＜0.05)。
　　6.大鼠原代皮層神經(jīng)元囊泡釋放實驗結(jié)果顯示，在限定的同一時間段內(nèi)，OGD/R組釋放神經(jīng)遞質(zhì)顯著減少(P＜0.01)，表明OGD/R損傷引起突觸囊泡神經(jīng)遞質(zhì)釋放的障礙，RD-1可以顯著逆轉(zhuǎn)這一障礙(P＜0.05)。同時，

10、體內(nèi)外western blot實驗均證明RD-1可改善損傷后突觸小體相關(guān)蛋白SNAP25和Complexin-1/2的表達(P＜0.05)。
　　7.大鼠原代皮層神經(jīng)元TUNEL染色結(jié)果表明，OGD/R損傷誘導細胞凋亡比率增加，RD-1給藥后可大幅降低凋亡水平。
　　8.體內(nèi)外Western blot實驗結(jié)果均顯示缺血再灌損傷可改變細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達:顯著降低Bcl-2蛋白的水平(P＜0.05)，升高Bax蛋白的表達（

11、P＜0.01），因而降低Bcl-2/Bax的比例(P＜0.05);RD-1在體外可明顯改善上述變化(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)，抑制凋亡;在體內(nèi)RD-1雖對Bcl-2的表達變化無明顯影響，但可顯著降低Bax蛋白的表達水平(P＜0.05)，并提高Bcl-2/Bax的比例(P＜0.01)，抑制凋亡。
　　綜上，RD-1在體內(nèi)外腦缺血再灌注損傷模型中均表現(xiàn)出良好的神經(jīng)保護作用，可顯著改善缺血再灌所致的線粒體功能障礙，減輕