肝外膽管系統(tǒng)中CD63+干細胞的識別鑒定及其修復肝臟損傷能力的研究.pdf

1、肝臟干細胞是一類具有自我更新能力并可分化為成熟肝細胞和膽管上皮細胞的肝臟原始細胞，它們參與肝臟發(fā)育、生長和損傷修復與再生的過程。在前期的研究中，我們發(fā)現肝干細胞作為細胞移植的治療用細胞與成熟肝細胞等其它類型細胞相比至少有以下優(yōu)點:1）肝臟干細胞植入受體后增殖能力強并有重構肝干細胞巢的潛能;2）肝干細胞可以分化為肝細胞、膽管上皮細胞和其他間質細胞;3）體外對肝干細胞的培養(yǎng)和擴增比成熟肝細胞相對容易;4）肝干細胞為原始未分化狀態(tài)細胞，相對于

2、其他細胞，免疫原性很低。因此，我們認為肝干細胞很可能是理想的肝臟疾病治療用細胞的來源。然而，現有的研究已經知道存在于肝臟內的干細胞的數量極少，再加上正常肝臟組織的來源很不容易，所以在基于肝干細胞肝臟疾病治療中多元的治療用細胞來源則是一個值得解決的問題。鑒于肝內和肝外膽管在發(fā)育上、功能上和空間上的連續(xù)性，以及其它實驗室關于肝外膽管中有干性細胞存在的報道，我們意識到了利用肝外膽管組織來解決肝臟疾病治療用干細胞來源匱乏的可能性?；谶@一考慮，

3、本研究希望回答兩個基本的生物學問題:1）肝外膽管中的什么細胞是真正的干細胞？2）它們是否具有類似的肝干細胞生物學特性和修復肝臟損傷的能力？
　　肝外膽管組織包括膽囊、囊管、左右肝管、肝總管和膽總管。有研究表明，正常肝外膽管系統(tǒng)中存在于/前體細胞（Biliary tree stem/progenitor cells，BTSCs），并認為這些細胞具有分化為成熟肝細胞、膽管上皮細胞或胰腺內分泌細胞等類型細胞的多項分化潛能。Rohan M

4、anohar等人在小鼠膽囊中發(fā)現并鑒定EpCAM+CD49fhi的上皮細胞具有干細胞的特征;Guido Carpino等人則利用EpCAM陽性細胞符合干細胞的特性，從人的膽囊內分離出EpCAM+K7+Lgr5+Sox17+Pdx1+的內胚層干細胞，發(fā)現分離獲得的這些細胞表現出未分化細胞的特征，并且在體外具有自我更新能力以及可以被誘導分化為多種類型的細胞。然而，這些研究中“干性細胞”群體依賴表面標志物EpCAM，而這個標志物不能區(qū)分膽管上

5、皮細胞和干細胞，具有異質性，且針對這些細胞只是簡單檢測了一些指標，并未深入研究細胞的相關特性?？偨Y起來，現有研究存在的主要問題有:1）缺少肝外膽管系統(tǒng)干細胞的特異性分子標志;2）缺少肝外膽管系統(tǒng)干細胞的體外培養(yǎng)體系;3）體內損傷修復能力不明確。本研究圍繞以上問題展開研究，試圖為肝外膽管系統(tǒng)中干細胞是否可以作為供體細胞在臨床上治療肝病中提供線索。
　　我們實驗室前期的研究表明CD63是肝內膽管干細胞特異性的表面分子標志物。因此，針對

6、目前缺少肝外膽管系統(tǒng)干細胞的特異性分子標志，我們嘗試以CD63為線索，來探討小鼠和人肝外膽管系統(tǒng)中是否有細胞表達CD63，以及這些細胞是否具有干細胞的特性和修復肝臟損傷的能力。首先，通過原位免疫組織化學染色分別檢測小鼠和人的肝外膽管內是否有細胞表達CD63，以及這些CD63+細胞是否共表達肝干細胞的分子標志。第二，以CD63為分選標志利用流式分選技術分離純化肝外膽管系統(tǒng)內的細胞，并對這些細胞的體外培養(yǎng)體系及生物學特性進行鑒定。第三，將分

7、離獲得的CD63細胞移植到肝損傷動物模型當中，觀察其是否具有再殖并修復疾病損傷的能力。
　　對于小鼠肝外膽管系統(tǒng)的研究發(fā)現:1）原位免疫組化染色顯示，小鼠肝外膽管系統(tǒng)存在干性細胞，且這些細胞共表達肝干細胞分子標志CK19、EpCAM和Alb，但不表達間質相關分子標志α SMA;我們利用Ⅳ型膠原酶和胰酶聯合處理消化小鼠肝外膽管組織，利用肝干細胞培養(yǎng)基ScmA可以將這些細胞在體外進行穩(wěn)定擴增，且這些細胞在基因和蛋白水平均表達EpCAM

8、、CK19、Alb、N-cadherin、Sox9、Pan-CK和E-Cadherin等肝干細胞分子標志，體外誘導分化實驗表明這些細胞能被誘導分化為成熟肝細胞樣細胞;2）鑒于CD63可以作為肝內肝干細胞特異性的分子標志，我們首先在原位鑒定了小鼠肝外膽管組織中存在CD63+細胞，且這些細胞共表達肝干細胞分子標志EpCAM、CK19、Alb和Lgr5;繼而通過流式分選將小鼠肝外膽管內CD63+細胞分離純化后，基于前期建立的肝干細胞培養(yǎng)基條件

9、，通過改良后添加生長因子:bFGF和VEGF，可以將這些細胞在體外穩(wěn)定培養(yǎng)和增殖（大于30代）;3）通過抽提RNA和細胞免疫熒光染色實驗發(fā)現，這些小鼠肝外膽管CD63+細胞在基因水平和蛋白水平表達CK19、Sox9和EpCAM等肝干細胞分子標志;4）體外誘導實驗顯示，小鼠CD63+細胞可以被誘導為具有合成糖原、吲哚菁綠的攝入和排出及具有LDL受體等成熟肝細胞的功能和表型，以及能夠形成囊管狀結構（且囊管結構內的細胞具有極性）和運輸羅丹明等

10、成熟膽管上皮細胞的功能;5）將標記了綠色熒光蛋白(GFP)的小鼠CD63+細胞移植入延胡索酰乙酰乙酸脫氫酶(Fumarylacetoacetate hydrolase，Fah)基因缺陷(Fah-/-)小鼠模型中，發(fā)現這些細胞不僅可以分化為成熟肝細胞來再殖入受損的肝臟(再殖效率可高達19.69％)，還可以分化為膽管上皮細胞（再殖效率可高達10.85％），這也是首次在Fah-/-小鼠體內觀察到有移植的干細胞可以分化為膽管上皮細胞。說明小鼠肝

11、外膽管系統(tǒng)中CD63+細胞確實是真正的干細胞，其不僅具有肝干細胞基本特性，而且具有較好的修復肝臟損傷的能力。
　　對于人肝外膽管系統(tǒng)的研究發(fā)現:1）與小鼠結果類似，在人的膽囊、囊管和膽總管中均有細胞表達CD63，且這些CD63+細胞共表達肝干細胞分子標志;2）通過Ⅰ型膠原酶消化的方法可以獲得肝外膽管組織的單細胞懸液，體外培養(yǎng)的這些細胞具有上皮樣形態(tài)和高核質比等干細胞特征，且在體外可以增殖3代以上;3）以CD63為分選標志通過流式分

12、選前后的肝外膽管細胞在基因和蛋白水平均表達肝干細胞相關分子標志。說明在人肝外膽管內存在干細胞，但是具體的分離純化和體外培養(yǎng)體系還需要深入的研究。
　　綜上所述，本研究發(fā)現了肝外膽管系統(tǒng)中干細胞的特異性表面分子標志，明確了其存在的空間位置，建立了其干細胞直接從肝外膽管組織中分離培養(yǎng)的技術體系，實現了其干細胞增殖與分化特性的研究。進而，完成了其干細胞在肝臟損傷小鼠模型中的再殖效率和治療作用的評估。這些研究成果的取得，正面地回答了我們最