IL-17在骨髓干細(xì)胞促進(jìn)肝損傷修復(fù)中的作用研究.pdf

1、【背景】
　　肝硬化是由各種慢性肝臟損害所導(dǎo)致的肝臟疾病晚期階段。對(duì)于失代償期肝硬化,內(nèi)科常規(guī)的保肝和對(duì)癥治療不能延長(zhǎng)患者生存期,原位肝移植是唯一有效的治療手段,但受供肝缺乏、費(fèi)用高昂等因素的嚴(yán)重限制。近年來(lái),隨著干細(xì)胞相關(guān)研究的不斷深入,自體骨髓源干細(xì)胞(Bone marrow-derived stem cells,BMSCs)用于人類多種疾病的治療取得了重要進(jìn)展。越來(lái)越多的臨床探索性研究發(fā)現(xiàn),自體BMSCs移植能有效地提升失代

2、償期肝硬化患者的肝功能。有關(guān)干細(xì)胞促進(jìn)肝功能恢復(fù)的機(jī)理,大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,除了轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞或與內(nèi)源肝細(xì)胞融合外,干細(xì)胞主要通過(guò)調(diào)控機(jī)體免疫狀態(tài)或肝臟免疫微環(huán)境而發(fā)揮作用。然而,自體BMSCs移植使機(jī)體免疫狀態(tài)發(fā)生了什么樣的變化仍未見(jiàn)報(bào)道。
　　本課題組前期進(jìn)行了自體干細(xì)胞移植治療失代償期肝硬化的臨床探索性研究。我們利用粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)將BM

3、SCs動(dòng)員到外周血中,再?gòu)耐庵苎蟹蛛x出干細(xì)胞,最后將獲得的干細(xì)胞通過(guò)血管介入回輸至患者肝動(dòng)脈。針對(duì)失代償期肝硬化患者的臨床隨機(jī)對(duì)照研究表明,與僅接受G-SCF處理的患者相比,接受自體干細(xì)胞移植的患者肝功能顯著提高。至2012年12月,我們對(duì)416例失代償期肝硬化患者進(jìn)行了自體干細(xì)胞移植治療,隨訪結(jié)果表明,干細(xì)胞治療顯著提高了患者的3年生存率(87％,對(duì)照組為29%)。我們對(duì)42例接受干細(xì)胞移植治療的患者進(jìn)行了免疫相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè),結(jié)果發(fā)

4、現(xiàn):在干細(xì)胞治療后第1、3、6、9、12月,患者外周血IL-17水平呈持續(xù)下降趨勢(shì),并與患者肝功能指標(biāo)的變化呈正相關(guān)。提示IL-17可能與BMSCs促進(jìn)肝功能恢復(fù)有關(guān)。
　　本研究將采用四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)制備小鼠肝損傷模型,并對(duì)肝損傷小鼠進(jìn)行同源BMSCs移植治療。利用這一模型,探討IL-17在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷和BMSCs改善肝損傷過(guò)程中的作用,為闡明BMSCs促進(jìn)肝病患者肝功能恢

5、復(fù)的機(jī)理提供理論依據(jù)。
　　【目的】
　　1.明確IL-17在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷中的作用;
　　2.闡明IL-17在BMSCs促進(jìn)小鼠肝損傷修復(fù)中的作用。
　　【方法】
　　1.采用CCl4腹腔注射誘導(dǎo)小鼠肝損傷。在肝損傷誘導(dǎo)過(guò)程中,H&E和天狼星紅染色檢測(cè)小鼠肝臟炎癥和纖維化程度,血漿生化檢測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、白蛋白(albumin,ALB),同

6、時(shí)采用ELISA檢測(cè)小鼠外周血IL-17水平,Real-timePCR檢測(cè)小鼠肝組織表達(dá)促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ、IL-17A、IL-17F以及IL-17RA和IL-17RC的水平,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝內(nèi)單核細(xì)胞中Th17細(xì)胞的百分比;
　　2.給予特異性抗小鼠IL-17抗體(Anti-IL-17mAb)或重組小鼠(Rm)IL-17干預(yù)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷過(guò)程,H&E和天狼星紅染色檢測(cè)小鼠肝臟炎癥和纖維化程

7、度,血漿生化檢測(cè)ALT、ALB,Real-timePCR檢測(cè)肝纖維化相關(guān)因子基質(zhì)金屬蛋白酶3(Matrix metalloproteinase 3,MMP3)、金屬蛋白酶組織抑制劑1(Tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1)和TGF-β1的表達(dá),免疫組化、Real-time PCR和Western blot檢測(cè)肝組織表達(dá)α-SMA的情況;
　　3.將同品系小鼠BMSCs經(jīng)尾靜脈移

8、植給CCl4誘導(dǎo)的肝損傷小鼠(5×106BMSCs/只),采用ELISA檢測(cè)小鼠外周血IL-17水平,Real-timePCR檢測(cè)小鼠肝組織IL-17A、IL-17F、IL-17RA、IL-17RC及IL-23p19的表達(dá)水平,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝內(nèi)單核細(xì)胞中Th17細(xì)胞的百分比;
　　4.給予Anti-IL-17mAb和RmIL-17因子干預(yù)BMSCs治療CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的過(guò)程,H&E和天狼星紅染色檢測(cè)肝組織炎癥和纖維化程度,

9、Real-timePCR檢測(cè)肝內(nèi)膠原層蛋白collagen-1的表達(dá),血清生化檢測(cè)小鼠肝功能(ALT和ALB水平)。
　　【結(jié)果】
　　1.IL-17與小鼠肝損傷過(guò)程密切相關(guān)
　　H&E、天狼星紅染色和血清生化檢測(cè)結(jié)果顯示,連續(xù)6周CCl4腹腔注射成功誘導(dǎo)出小鼠肝損傷模型,表現(xiàn)為肝組織內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維化形成,外周血ALT升高而ALB水平顯著降低。ELISA、Real-timePCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在CCl

10、4誘導(dǎo)肝損傷過(guò)程中,外周血IL-17水平和肝組織內(nèi)IL-17A、IL-17F、IL-17RA、IL-17RC、IL-6、IL-8、TNF-α的表達(dá)水平逐漸升高,而肝組織內(nèi)Th17細(xì)胞百分比和IFN-γ的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。當(dāng)撤除CCl4后,小鼠肝損傷逐漸恢復(fù),外周血IL-17水平和肝組織內(nèi)IL-17A、IL-17F、IL-17RA、IL-17RC、IL-6、IL-8、TNF-α的表達(dá)水平也逐漸恢復(fù)至幾乎正常。
　　2.IL-17促

11、進(jìn)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷
　　在用CCl4制備小鼠肝損傷過(guò)程中,和僅給予CCl4腹腔注射組相比,聯(lián)合注射RmIL-17能顯著加重小鼠肝損傷,而聯(lián)合注射Anti-IL-17mAb卻顯著減輕CCl4誘導(dǎo)的肝損傷。Real-timePCR、免疫組化和Westernblot結(jié)果顯示,與單純使用CCl4相比,聯(lián)合使用CCl4和RmIL-17顯著增加了肝組織內(nèi)MMP3、TIMP1、TGF-β1、α-SMA的表達(dá),而聯(lián)合使用CCl4和Anti-

12、IL-17mAb卻抑制了MMP3、TIMP1、TGF-β1、α-SMA的表達(dá)。
　　3.同源BMSCs下調(diào)小鼠IL-17表達(dá)水平
　　同源BMSCs移植治療能有效改善CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷。在BMSCs促進(jìn)肝損傷恢復(fù)的同時(shí),小鼠外周血IL-17水平也明顯下降,逐漸恢復(fù)至幾乎正常水平;肝組織內(nèi)IL-23p19、IL-17A、IL-17F、IL-17RA和IL-17RC的表達(dá)也顯著下降;但是肝內(nèi)Th17細(xì)胞百分比無(wú)明顯變化。<

13、br>　　4.IL-17在BMSCs促進(jìn)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷修復(fù)過(guò)程中起重要作用
　　在BMSCs移植治療CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷過(guò)程中,加入外源性RmIL-17顯著減弱了BMSCs的治療效果。與BMSCs治療組相比,BMSCs聯(lián)合RmIL-17組小鼠的肝組織炎癥和纖維化顯著加重。采用Anti-IL-17mAb對(duì)肝損傷小鼠治療,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能顯著減輕肝組織炎癥和纖維化程度,且與BMSCs移植治療組無(wú)明顯差異。
　　【結(jié)論】