IL-17對肝細胞肝癌的促進作用及機制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行了論述。
　　第一部分:IL-17在肝細胞肝癌中的作用研究
　　目的:研究IL-17在肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法:建立三種小鼠肝細胞肝癌動物模型:皮下異位移植性模型、肝臟原位移植性模型和DEN誘導(dǎo)性模型。利用IL-17敲除小鼠,在肝癌模型中觀察腫瘤的發(fā)生發(fā)展情況。應(yīng)用CD8中和抗體剔除荷瘤小鼠體內(nèi)的CD8+T細胞觀察腫瘤生長情況。利用RT-PCR和流式細胞術(shù)檢測Hepa1-6細胞表面IL

2、-17R的表達情況。利用MTT法c法檢測IL-17對Hepa1-6細胞增殖和凋亡的影響。利用流式細胞術(shù)檢測荷瘤的正常小鼠、IL-17-/-小鼠以及額外給予rmIL-17小鼠腫瘤浸潤淋巴細胞中免疫細胞亞群(T細胞亞群、效應(yīng)性 T細胞、記憶性 T細胞、NK、NKT、Treg、DCs、MΦ、中性粒以及MDSCs)的比例。胞內(nèi)染色檢測CD4+T細胞和CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ的水平。乳酸脫氫酶釋放法檢測抗原致敏的脾臟淋巴細胞對Hepa1-6細

3、胞的殺傷作用。CBA法檢測荷瘤小鼠血清中細胞因子IFN-γ,IL-2和TNF-α的水平。CFSE法和流式細胞術(shù)檢測IL-17對CD8+T細胞增殖和分泌細胞因子的影響。
　　結(jié)果:(1)成功建立了三種小鼠肝細胞肝癌動物模型:皮下異位移植性模型、肝臟原位移植性模型和DEN誘導(dǎo)性模型。
　　(2)在小鼠皮下異位模型中,IL-17-/-小鼠的腫瘤生長和WT小鼠相比明顯減慢,而額外給予WT小鼠rmIL-17后則能夠加速腫瘤的生長;與皮

4、下肝癌模型結(jié)果相似,在原位肝癌模型中,IL-17-/-小鼠的腫瘤生長和WT小鼠相比明顯減慢,而額外給予WT小鼠rmIL-17后能夠顯著加速腫瘤的生長;在DEN誘導(dǎo)的肝癌模型中,IL-17-/-小鼠的腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量明顯減少,相應(yīng)腫瘤結(jié)節(jié)的體積也較小,而額外給予WT小鼠rmIL-17后能增加腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量和體積。
　　(3)RT-PCR和流式細胞術(shù)檢測到Hepa1-6細胞表面有較低水平的IL-17R;MTT結(jié)果顯示IL-17對Hepa

5、1-6細胞的增殖沒有直接作用,既不促進也不抑制其增殖;Annexin-V/PI法結(jié)果表明IL-17對Hepa1-6細胞的凋亡也沒有直接作用。
　　(4)和WT小鼠相比,IL-17-/-小鼠的腫瘤浸潤淋巴細胞中CD8+T細胞顯著增多,活化和記憶性的CD8+T細胞也增多,但是CD4+T細胞卻沒有明顯變化,調(diào)節(jié)性 CD4+T細胞(Treg)的比例也沒有明顯變化;表達 IFN-γ的CD8+T細胞(CTL)在IL-17-/-小鼠中顯著升高,

6、但是表達IFN-γ的CD4+T細胞(Th1)卻沒有變化;IL-17-/-小鼠血清中IFN-γ,IL-2和TNF-α的水平顯著高于WT小鼠,額外給予rmIL-17后則進一步下調(diào)了這些細胞因子的水平;IL-17-/-小鼠脾臟淋巴細胞和CD8+T細胞的殺傷能力明顯強于WT小鼠;剔除CD8+T細胞后IL-17-/-小鼠的腫瘤體積和WT小鼠相比沒有差別。
　　(5)IL-17既不能夠抑制CD8+T細胞的應(yīng)答,其分泌的IFN-γ和TNF-α的

7、水平?jīng)]有明顯減少;也不能抑制CD8+T細胞的增殖。
　　(6)IL-17-/-小鼠的腫瘤微環(huán)境中的粒細胞樣(Granulocytic)和單核細胞樣(Monocytic)MDSCs均顯著減少,體外給予正常小鼠rmIL-17后能顯著增加腫瘤局部兩類MDSCs的浸潤;而DCs,MΦ、中性粒細胞卻沒有明顯變化。
　　結(jié)論:IL-17對肝細胞肝癌的發(fā)生發(fā)展具有促進作用,IL-17不是直接促進腫瘤細胞的增殖,而是通過調(diào)節(jié)CTLs的抗腫瘤

8、免疫應(yīng)答來間接發(fā)揮促進作用;這一作用可能是通過MDSCs細胞進行的,而非直接抑制CTLs的功能。
　　第二部分:腫瘤微環(huán)境中IL-17的來源探究
　　目的:研究肝細胞肝癌發(fā)展過程中腫瘤微環(huán)境中的IL-17的來源。
　　方法:利用原位肝細胞肝癌模型,通過胞內(nèi)染色的方法對腫瘤浸潤淋巴細胞中能夠分泌IL-17的細胞進行篩查,聯(lián)合使用多種流式抗體對分泌IL-17的細胞進行表型鑒定。利用TCR-Vγ的PCR引物檢測肝臟中γδT細

9、胞的亞群。使用TCR-δ-/-小鼠,比較γδT細胞缺失情況下腫瘤的生長情況,ELISA檢測荷瘤小鼠血清中IL-17的水平。采用體內(nèi)剔除Vγ4γδT細胞或者過繼性輸注WT或IL-17-/-來源的Vγ4γδT細胞的方法觀察Vγ4γδT細胞來源的IL-17對肝細胞肝癌的促進作用。流式檢測荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中免疫細胞亞群(T細胞亞群、效應(yīng)性 T細胞、記憶性T細胞、DCs、MΦ、中性粒以及MDSCs)的比例。胞內(nèi)染色檢測CD4+T細胞和CD8+T

10、細胞產(chǎn)生IFN-γ的水平。
　　結(jié)果:(1)CD3+的T淋巴細胞是IL-17的主要來源;CD4+T細胞,CD8+T細胞以及γδT均能夠分泌IL-17,而以分泌IL-17的γδT細胞數(shù)目最多;γδT細胞產(chǎn)生的IL-17占到所有IL-17+細胞的60％,同時其數(shù)量是Th17細胞的四倍多;分泌IL-17的γδT細胞呈現(xiàn)ROR-γt+CD27-CCR6+表型。
　　(2)肝臟中存在所有6種γδT細胞亞群;流式檢測表明Vγ4細胞亞群是

11、產(chǎn)生 IL-17的主要細胞,75％的分泌IL-17的γδT細胞是Vγ4亞群。
　　(3)敲除了γδT細胞之后,肝細胞肝癌的生長受到了顯著抑制;血清中IL-17的水平明顯下降;CD8+T細胞的抗腫瘤應(yīng)答顯著增強記憶性的CD8+T細胞顯著增加,CD8+T細胞分泌的IFN-γ也顯著增加。
　　(4)剔除了Vγ4細胞之后,和WT小鼠比較腫瘤體積明顯減小;腫瘤浸潤的IL-17+γδT細胞數(shù)量顯著減少了,但是Th17細胞的數(shù)量卻沒有變化

12、;血清中IL-17的水平也顯著下降;CD8+T細胞的抗腫瘤應(yīng)答顯著增強,記憶性的CD8+T細胞顯著增加,CD8+T細胞分泌的IFN-γ也顯著增加。
　　(5)輸注WT來源的Vγ4γδT細胞的TCRδ-/-小鼠其腫瘤體積與WT小鼠相比無差異,而輸注IL-17-/-來源的Vγ4γδT細胞的TCRδ-/-小鼠其腫瘤體積顯著小于WT小鼠,也顯著小于輸注WT來源的Vγ4γδT細胞的TCRδ-/-小鼠;輸注IL-17-/-來源的Vγ4γδT細

13、胞的TCRδ-/-小鼠具有更強的抗腫瘤應(yīng)答,記憶性的CD8+T細胞和CD8+T細胞分泌的IFN-γ顯著增加。
　　結(jié)論:腫瘤微環(huán)境中的IL-17的來源,不是獲得性免疫的Th17細胞,而是固有免疫的Vγ4γδT細胞亞群。Vγ4γδT細胞來源的IL-17促進了肝細胞肝癌的發(fā)生發(fā)展。
　　第三部分:IL-17促進肝細胞肝癌發(fā)展的機制研究
　　目的:研究IL-17促進肝細胞肝癌發(fā)展的具體調(diào)控機制。
　　方法:利用RT-P

14、CR和流式細胞術(shù)檢測MDSCs細胞表面IL-17R的表達情況。Transwell實驗檢測IL-17對MDSCs的趨化作用。流式細胞術(shù)檢測MDSCs細胞表面CXCR2和CXCR4的表達情況。Realtime PCR檢測IL-17處理的肝癌細胞Hepa1-6趨化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL20、CXCL12和CXCL5的表達水平的變化。Transwell實驗檢測IL-17處理的腫瘤細胞的上清對MDSCs的趨化作用。給予荷瘤小鼠C

15、XCR2的拮抗劑SB265610或CXCR4的拮抗劑AMD3100以及rmIL-17的聯(lián)合處理,觀察CXCL5/CXCR2軸或者CXCL5/CXCR4軸在IL-17介導(dǎo)的體內(nèi)MDSCs趨化中的作用。將MDSCs與OT-I來源的CD8+T細胞進行了共培養(yǎng),并加入rmIL-17或者anti-IL-17,利用特異性的刺激(SIINFEKL)來觀察IL-17是否可以增強MDSCs對CD8+T細胞的抑制作用。CFSE和3H-TdR檢測MDSCs對

16、CD8+T細胞增殖的影響。利用Gr-1抗體和吉西他濱剔除小鼠體內(nèi)的MDSCs觀察在體內(nèi)情況下IL-17介導(dǎo)的MDSCs的增強抑制作用。將純化的MDSCs與γδT細胞進行了共培養(yǎng),利用流式和ELISA方法檢測共培養(yǎng)體系中γδT細胞分泌IL-17的水平。在共培養(yǎng)體系中加入IL-1β和IL-23的中和抗體研究MDSCs促進γδT細胞產(chǎn)生IL-17的機制。在MDSCs與γδT細胞共培養(yǎng)體系中加入了外源的rmIL-17和IL-17的中和抗體,研究

17、IL-17對MDSCs誘導(dǎo)γδT細胞分泌IL-17的增強效果。
　　結(jié)果:(1)流式細胞術(shù)和RT-PCR的方法檢測發(fā)現(xiàn)MDSCs表達IL-17R,但是體外趨化實驗表明IL-17不能直接誘導(dǎo)MDSCs遷移。
　　(2)MDSCs表達CXCR2和CXCR4這兩種趨化因子受體;IL-17處理后的腫瘤細胞可以顯著上調(diào)CCL2、CCL5、CCL7、CCL20、CXCL12和 CXCL5的表達;但是檢測腫瘤微環(huán)境中這些趨化因子的表達水平

18、后發(fā)現(xiàn),只有CXCL5具有明顯的上調(diào);Transwell實驗表明,IL-17處理后的腫瘤細胞上清可以顯著促進MDSCs的遷移,且具有劑量依賴性,當(dāng)加入anti-IL-17或者CXCR2的拮抗劑SB265610后可以顯著抑制這一趨化作用。
　　(3)給予rmIL-17的荷瘤小鼠經(jīng)CXCR2的拮抗劑SB265610處理后腫瘤顯著減小,腫瘤局部的MDSCs數(shù)量也顯著降低,機體 CD8+T細胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答也隨著MDSCs的減少而顯著增

19、強。
　　(4)CFSE和3H-TdR實驗均表明IL-17可以增強MDSCs對CD8+T細胞的增殖,細胞因子分泌實驗表明IL-17還可以以劑量依賴性的方式增強MDSCs對CD8+T細胞分泌IFN-γ和TNF-α的抑制作用,IL-17主要顯著增強單核細胞樣MDSCs對CD8+T細胞的抑制功能。
　　(5)剔除rmIL-17處理的荷瘤小鼠內(nèi)的MDSCs之后腫瘤體積顯著減小,腫瘤部位的MDSCs細胞的數(shù)量也明顯減少,伴隨著MDSC

20、s的減少,腫瘤微環(huán)境中的CTL應(yīng)答顯著增強。
　　(6)利用抗體或者吉西他濱剔除小鼠體內(nèi)的MDSCs,或者使用趨化因子CXCR2受體拮抗劑抑制MDSCs到達腫瘤部位后,腫瘤微環(huán)境中IL-17的產(chǎn)生顯著減少,不僅γδT細胞分泌的IL-17顯著減少,Th17細胞分泌的IL-17也相應(yīng)顯著減少了。
　　(7)MDSCs可以誘導(dǎo)γδT細胞分泌大量的IL-17,而利用IL-1β和IL-23的中和抗體以及IL-1R-/-小鼠,我們發(fā)現(xiàn)M

21、DSCs誘導(dǎo)γδT細胞分泌IL-17的作用部分依賴于IL-1β和IL-23,而粒細胞樣(Granulocytic)MDSCs具有更強的誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-17的能力。
　　(8)IL-17可以顯著增強MDSCs對γδT細胞的誘導(dǎo)作用,而且這一增強效果具有劑量依賴性,當(dāng)加入IL-17中和抗體后可以部分阻斷這一過程,IL-17處理MDSCs后可以促進其分泌IL-1β和IL-23。
　　結(jié)論:IL-17可以誘導(dǎo)腫瘤細胞分泌大量的CXCL