小分子化合物誘導(dǎo)大鼠肝干樣細(xì)胞向胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的：用小分子化合物在體外誘導(dǎo)肝干樣細(xì)胞分化為胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞，建立一種以肝干樣細(xì)胞來源的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞的非轉(zhuǎn)基因的實(shí)驗(yàn)方法，為進(jìn)一步建立肝干細(xì)胞高效、特異的向胰腺β細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的技術(shù)體系的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：選用5-氮雜胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine，5-AZA），曲古霉素A(TrichostatinA，TSA)，維甲酸(Retinoic acid，RA)，胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒(Insulin，tran

2、sferrin andselenite，ITS)等小分子化合物，分兩步法直接誘導(dǎo)肝干樣WB-F344細(xì)胞（WB細(xì)胞）分化為表達(dá)胰腺十二指腸同源框蛋白1(Pancreatic and duodenal homeoboxfactor1，PDX1)的胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞，用含有1uM-10uM10個(gè)不同濃度5-AZA分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)WB分化，摸索誘導(dǎo)分化的最佳條件。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、免疫熒光和

3、葡萄糖刺激試驗(yàn)對第一步誘導(dǎo)細(xì)胞（WB-1細(xì)胞）和胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞（WB-A細(xì)胞）進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：⑴顯微鏡觀察:5-AZA5 uM處理2d，TSA1 d，約20％ WB細(xì)胞由橢圓形或多邊形向梭狀細(xì)胞改變，此時(shí)細(xì)胞為WB-1細(xì)胞;WB-1經(jīng)RA聯(lián)合ITS誘導(dǎo)7d，細(xì)胞形態(tài)類似于WB-1細(xì)胞，但核漿比例增大，此時(shí)細(xì)胞為WB-A細(xì)胞。⑵WB-1細(xì)胞RT-PCR結(jié)果:WB細(xì)胞不表達(dá)胰腺相關(guān)基因，表達(dá)ALB，AFP，GLUT2等基因。

4、WB-1細(xì)胞中未表達(dá)PDX1及其它胰腺發(fā)育相關(guān)基因，肝細(xì)胞表達(dá)基因ALB，AFP和標(biāo)志肝細(xì)胞去分化的基因C/EBPβ開始下調(diào)。⑶WB-A細(xì)胞定量PCR和半定量PCR結(jié)果:5-AZA濃度為5 uM時(shí)，獲得的WB-A細(xì)胞PDX1表達(dá)量最高，標(biāo)志肝干細(xì)胞分化的基因C/EBPβ下調(diào);WB-A表達(dá)NGN3，Neurod，NKX2.2等胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞相關(guān)基因;Nestin持續(xù)表達(dá)，Insulin1表達(dá)上調(diào)。⑷WB-A細(xì)胞免疫熒光:WB-A細(xì)胞P