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文檔簡介
1、多能干細胞(pluripotent stem cell,PSC)的遺傳物質穩(wěn)定性對于遺傳信息的準確傳遞和機體的正常生命活動至關重要。多能干細胞包括胚胎干細胞(embryonic stem cell,ESC)與誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPS)。胚胎干細胞在無限增殖過程中能保持遺傳物質高度穩(wěn)定性。迄今為止,對維持遺傳物質穩(wěn)定性的相關機制研究主要集中在體細胞上,而我們對胚胎干細胞維持遺傳
2、物質穩(wěn)定性的相關機制研究并不全面,因此深入開展胚胎干細胞在遺傳物質穩(wěn)定性維持方面的相關研究有助于我們認識并了解胚胎干細胞的特性,為胚胎發(fā)育、胚胎干細胞的醫(yī)學應用提供基礎理論依據(jù)。Filia,又名Khdc3(KH domain containing 3),特異性表達于小鼠生長中的卵母細胞、囊胚以及胚胎干細胞中,是ESC維持遺傳物質穩(wěn)定性的關鍵多功能蛋白分子。Filia可通過兩個方面的作用來維持小鼠胚胎干細胞遺傳物質的穩(wěn)定性。一、Filia
3、能與多能干細胞特異性蛋白Floped相互結合,促進停滯復制叉的重啟,減少由復制壓力所引起的細胞內源性損傷。二、Filia參與調控小鼠胚胎干細胞的DNA損傷反應(DNA damage response,DDR),從而維持遺傳物質的穩(wěn)定性。實驗室前期工作基礎發(fā)現(xiàn),F(xiàn)ilia S151位點以及Filia S349位點對Filia的功能發(fā)揮至關重要。Filia第349位絲氨酸殘基與蛋白的入核相關,在損傷誘導情況下,F(xiàn)ilia S349能被相關激
4、酶磷酸化修飾,磷酸化的Filia能順利轉運至細胞核中,參與DNA損傷修復過程。Filia第151位絲氨酸殘基的磷酸化修飾參與復制叉重啟的過程,當復制叉受阻時,F(xiàn)ilia-Floped聚集到受阻的復制叉上,在蛋白激酶ATR的調控下,F(xiàn)ilia的第151位絲氨酸發(fā)生磷酸化,重啟復制叉。FILIA蛋白除了能被磷酸化修飾外,還能被泛素化修飾。前期FILIA的P-MS(免疫共沉淀-質譜)結果發(fā)現(xiàn)Filia有四個泛素化位點,但我們還不清楚這四個泛素
5、化位點是否參與調控細胞的損傷修復功能,調控方式是否獨立。在本論文中,我們探究了Filia泛素化修飾在Filia蛋白調控胚胎干細胞遺傳物質穩(wěn)定性及DNA損傷反應的相關功能。
為探究泛素化修飾是否和怎樣調控Filia在胚胎干細胞中的功能,本論文用分子克隆構建出9個Filia泛素化位點突變的慢病毒表達載體,利用慢病毒包裝與感染等手段,得到9個Filia泛素化位點突變的小鼠胚胎干細胞系。功能研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)ilia第141位賴氨酸的泛素化
6、是Filia蛋白調控DNA損傷反應的關鍵,該泛素化位點突變后,小鼠胚胎干細胞系維持較高的內源性DNA損傷。并且FiliaK141突變后影響Filia DNA損傷修復的能力。深入探究Filia第141位賴氨酸的泛素化對損傷修復的影響機制,我們發(fā)現(xiàn)Filia K141的突變后并不影響Filia與PARP1(細胞質中與DDR調控相關的重要蛋白修飾酶)的結合,但Filia K141突變后,F(xiàn)ilia S349不能被磷酸化,且Filia不能轉運到
7、細胞核中。綜上,F(xiàn)ilia泛素化修飾對Filia調控胚胎干細胞遺傳物質穩(wěn)定性十分重要。當胚胎干細胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂時,F(xiàn)ilia能定位到斷裂處,調控同源重組修復雙鏈斷裂。FiliaK141泛素化位點突變后,使Filia S349位點不能被磷酸化修飾,進而FILIA蛋白的入核受影響,F(xiàn)ILIA不能定位到受損的DNA位點,修復損傷位點。
盡管我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Filia K141位點十分重要,但是現(xiàn)有的證據(jù)并不能揭示Filia泛素化修
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