人尿液來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化為晶狀體小體的新方法建立及在晶狀體發(fā)育機制研究中的運用.pdf

1、目的:
　　白內(nèi)障是全球最主要的致盲眼病之一，手術(shù)是目前唯一有效的治療途徑。隨著我國老齡化的加劇，白內(nèi)障手術(shù)的需求量每年大幅增加，由此給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。近期兩個研究團隊分別發(fā)現(xiàn)兩個對白內(nèi)障可能有治療作用的藥物，并在細(xì)胞以及動物模型上獲得良好效果，由此為白內(nèi)障的藥物治療打開新的思路，但由于人源的體外晶狀體模型的缺乏，這類藥物在人源上的驗證未能實現(xiàn)。因此，本學(xué)位論文旨在利用人源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(h-iPSCs)定向分化獲得人晶狀

2、體小體(LB)，構(gòu)建合適的具有晶狀體光學(xué)特性的體外晶狀體模型并在此基礎(chǔ)上進行晶狀體發(fā)育機制研究。
　　方法:
　　首先收集分離人尿液中的上皮細(xì)胞，用慢病毒做載體將“Yamanaka四因子”轉(zhuǎn)入尿液細(xì)胞將其重編程獲得iPSCs，通過堿性磷酸酶染色、多能干細(xì)胞標(biāo)志物（SOX2、SSEA-4、Nanog、TRA1-81、OCT4）的免疫熒光染色及RT-qPCR、擬胚體形成實驗以及畸胎瘤實驗驗證iPSCs的多能性。
　　其次，

3、我們創(chuàng)立了“荷包蛋法”將iPSCs誘導(dǎo)分化成成熟、具有光學(xué)特性的LB，通過免疫熒光染色及RT-qPCR檢驗LB分化過程的晶狀體發(fā)育標(biāo)志物(DLX3、SIX1、EYA1、PAX6、CRYAA、CRYAB、PROX1、FOXE3、SOX1、CRYB、CRYGC、MIP)的動態(tài)表達(dá)，驗證LB分化過程和晶狀體胚胎發(fā)育的對應(yīng)性，用透射電鏡和亞甲藍(lán)染色等檢測成熟LB的細(xì)微結(jié)構(gòu)驗證其與晶狀體的相似性，通過“X”實驗檢測成熟LB的光學(xué)特性（透明度以及放

4、大倍率）。
　　最后通過基因芯片檢測iPSCs和LB中mRNA和lncRNA的差異表達(dá)，用RT-qPCR對部分自噬相關(guān)基因及其對應(yīng)lncRNA、晶狀體發(fā)育相關(guān)基因及其對應(yīng)lncRNA進行驗證并從中篩選出lncRNA p10540做進一步功能研究。利用siRNA沉默lncRNA p10540表達(dá)，同時檢測LC3B在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。通過對老年性患者以年齡分組并提取其囊膜RNA檢測lncRNA p10540和老年性白內(nèi)障的

5、相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　我們利用人尿液來源的上皮細(xì)胞成功重編程獲得iPSCs，該iPSCs磷酸酶染色呈強陽性、表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)志物、能形成完美的擬胚體，將其注射入裸鼠中可獲得有三個胚層組織和細(xì)胞的畸胎瘤。
　　通過“荷包蛋法”誘導(dǎo)iPSCs可獲得成熟LB，其分化過程有晶狀體板期、早期晶狀體期及成熟晶狀體期，與晶狀體胚胎發(fā)育一一對應(yīng)。成熟LB表達(dá)晶狀體纖維細(xì)胞標(biāo)志物（CRYAA、CRYAB、CRYB、CRYGC、MIP

6、），具有晶狀體上皮細(xì)胞、晶狀體纖維細(xì)胞以及囊膜等結(jié)構(gòu)，且具有良好的透明性和1.7倍的放大倍率。
　　自噬存在于LB分化過程中，該現(xiàn)象與小鼠晶狀體胚胎發(fā)育相似。基因芯片結(jié)果提示自噬基因相對應(yīng)lncRNA在LB分化過程中的差異表達(dá)，lncRNA p10540在LB分化過程中通過在細(xì)胞胞漿中增強LC3B向活化狀態(tài)LC3BⅡ的轉(zhuǎn)化而影響自噬作用，此外在年齡＞75歲組中l(wèi)ncRNAp10540的表達(dá)明顯下降。
　　結(jié)論:
　　人