Aurora-A誘導(dǎo)BRCA2磷酸化及其與癌癥的關(guān)系研究.pdf

1、學(xué)校代碼：10270分類號(hào)：Q95學(xué)號(hào)：142200786碩士學(xué)位論文AuraA誘導(dǎo)BRCA2磷酸化及其與癌癥的關(guān)系研究學(xué)院：生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院專業(yè)：動(dòng)物學(xué)研究方向：動(dòng)物細(xì)胞分子生物學(xué)研究生姓名：劉凱伊指導(dǎo)教師：萬(wàn)平完成日期:2017.03.22摘要上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文I性對(duì)照）、AuraA與BRCA2兩對(duì)蛋白質(zhì)間體外磷酸化反應(yīng)體系。最后成功在體外構(gòu)建了各體外純化蛋白、檢測(cè)出了適宜的磷酸化反應(yīng)體系，并最終驗(yàn)證出BRCA2受AuraA

2、在磷酸化體系中誘導(dǎo)后，于其序列靠近C端30643208位點(diǎn)之間的蘇氨酸(threoninethr)上發(fā)生磷酸化。本實(shí)驗(yàn)包括以下四個(gè)部分：1BRCA2BRCA2的體外分段擴(kuò)增的體外分段擴(kuò)增本實(shí)驗(yàn)首先運(yùn)用PCR技術(shù)、以設(shè)計(jì)好的兩端帶有NotI和SalI兩個(gè)酶切位點(diǎn)（這兩個(gè)酶切位點(diǎn)載體上有而B(niǎo)RCA2片段上沒(méi)有）的16對(duì)引物將BRCA2以擴(kuò)增的形式分成大小不等的16段。并將酶切后的16段BRCA2片段分別與酶切后的原核載體PGEX4T3連接，

3、讓其粘性末端結(jié)合，重新交叉重組，構(gòu)建重組原核質(zhì)粒。隨后以BL21原核桿菌為基因復(fù)制載體，運(yùn)用轉(zhuǎn)化等技術(shù)手段將16個(gè)重組質(zhì)粒導(dǎo)入原核細(xì)胞BL21中，并在適宜條件下培養(yǎng)促進(jìn)重組質(zhì)粒在原核細(xì)胞中的大量復(fù)制。最后用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在不同條件下誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，通過(guò)蛋白印跡法(westernblot)用GST抗體檢測(cè)16個(gè)PGEX4T3BRCA2fragment1~16重組質(zhì)粒在不同條件下表達(dá)的蛋白量，并篩選出最優(yōu)條件。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，

4、我們成功誘導(dǎo)表達(dá)出16個(gè)PGEX4T3BRCA2fragment1~1重組質(zhì)粒的蛋白，且為每一個(gè)片段找到了能表達(dá)最優(yōu)蛋白量的條件。2AuraAAuraA激酶誘導(dǎo)激酶誘導(dǎo)P53P53磷酸化磷酸化已有研究明確表明，AuraA會(huì)誘導(dǎo)P53蛋白于絲氨酸(serineser)315位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，所以我們選擇AuraA與P53蛋白的磷酸化反應(yīng)作為檢測(cè)磷酸化體系有效性的陽(yáng)性對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)同樣用第一部分中的方法構(gòu)建了以PGEX4T3為載體的PGRX4T