深海熱液口微生物-病毒互作及其次生代謝產物抗腫瘤轉移活性的研究.pdf

1、深海熱液口是地球上最極端的環(huán)境之一，具有黑暗、高壓、低氧、缺乏營養(yǎng)以及富含多種礦物質等特點。自從上世紀70年代發(fā)現(xiàn)深海熱液口存在獨特的生物群落以來，深海熱液口生態(tài)系統(tǒng)受到了海洋學家廣泛的關注并成為了海洋生物學和生態(tài)學研究領域的熱點之一。在深海熱液口生態(tài)系統(tǒng)中，化能自養(yǎng)古菌和細菌利用熱液口環(huán)境中的熱能和化學能合成有機質，為熱液口其他生物提供營養(yǎng)物質，構成了深海熱液口生態(tài)系統(tǒng)的基礎，對整個熱液口生物群落結構具有調控作用。然而近年來的研究發(fā)現(xiàn)

2、熱液口病毒具有極高的豐度，病毒可能對微生物以及整個熱液口生物群落結構都具有重要的調控作用。因此，研究深海熱液口病毒與微生物的相互作用對了解熱液口生態(tài)系統(tǒng)具有十分重要的意義。
　　由于熱液口環(huán)境中溫度和化學梯度的動態(tài)變化，使得熱液口微生物群落的多樣性和豐度可能存在差異，因此我們首先對東太平洋中脊、南大西洋和西南印度洋海隆深海熱液口硫化物、水體和底棲動物腸道樣本中細菌的多樣性進行分析。細菌16S rRNA基因序列分析結果表明，Prot

3、eobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes在三大洋深海熱液口中均為優(yōu)勢細菌門類，說明不同海區(qū)熱液口細菌群落結構在優(yōu)勢菌群組成上存在一定程度的共性;但是，三大洋在細菌群落多樣性和豐度方面具有很大的差異性。研究表明，熱液口水體中細菌多樣性要明顯小于硫化物的細菌多樣性，而動物腸道中的細菌多樣性最小。結果顯示，動物腸道細菌的絕大多數(shù)細菌門類都存在于硫化物細菌中，說明微生物是熱液口底棲動物的主要食物來源，是深海

4、熱液口生態(tài)系統(tǒng)的初級生產者。
　　通過對深海熱液口細菌群落結構的研究，我們發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)熱液口細菌群落結構存在差異，而病毒與宿主菌之間的相互作用可能是造成這種差異的主要原因，因此我們對深海熱液口病毒與宿主之間的互作進行了進一步研究。根據(jù)傳統(tǒng)方法從環(huán)境樣品中分離病毒需要的樣品量較大，而目前的采樣技術很難從深海熱液口環(huán)境采集大量樣品并提取到足夠的病毒宏基因組DNA，因此對深海病毒的研究變得尤為困難。在本研究中，我們首先對熱液口樣品的病毒

5、分離以及病毒宏基因組提取技術進行改進，利用PEG6000處理結合超高速離心的方法對病毒顆粒進行濃縮，再采用全基因組擴增方法對提取到的病毒宏基因組DNA進行擴增，提高病毒宏基因組DNA的濃度。通過透射電鏡觀察和熒光定量PCR檢測內參病毒GVE2拷貝數(shù)等方法，結果表明采用改進后的病毒分離及病毒宏基因組提取和擴增的方法，病毒分離效率較好，病毒宏基因組DNA濃度可以滿足宏基因組高通量測序的要求。利用改進后的方法，從西南印度洋深海熱液口3個站點的

6、沉積物樣品中，分別獲得了病毒和微生物宏基因組DNA，并進行了高通量測序分析。分析結果表明，熱液口病毒功能基因和微生物功能基因的分類較為相似，其中與氨基酸運輸與代謝、轉錄、無機鹽運輸與代謝、細胞膜和細胞壁代謝和能量生成與轉化相關基因等與基因轉錄和生物大分子合成代謝相關基因所占比例較高。在病毒宏基因組中，發(fā)現(xiàn)一類與細胞膜和細胞壁代謝相關的功能基因，其中包含了與噬菌體裂解相關的糖基轉移酶、二肽酶和N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，表明在一定的條件下

7、熱液口病毒對微生物具有裂解作用。通過KEGG(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes)代謝通路分析，結果發(fā)現(xiàn)病毒的功能基因不僅參與微生物的代謝過程，而且還存在一些病毒特有的功能基因（如葡糖激酶、6-磷酸果糖激酶1、羥酰谷胱甘肽水解酶、D-乳酸脫氫酶、乙酸激酶和乙醛脫氫酶等的編碼基因）使得微生物的代謝通路更加完善，對微生物的代謝通路具有一定的補償作用，從而增強了微生物對環(huán)境的適應性。本文的研究結果表明

8、，深海熱液口病毒能夠對熱液口微生物群落結構和代謝過程進行調控，進而影響整個熱液口生態(tài)系統(tǒng)。
　　通過對深海熱液口微生物與病毒相互作用的研究發(fā)現(xiàn)，熱液口病毒會影響宿主的代謝過程。微生物在受到病毒侵染的過程中會發(fā)生一系列代謝變化，這與腫瘤在發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)生代謝改變具有一定相似性，因此熱液口病毒感染宿主菌產生的次生代謝產物可能具有抗腫瘤活性。由于深海熱液口極端的生態(tài)環(huán)境以及熱液口存在豐富的生物資源，使得熱液口微生物次生代謝產物無論是

9、在分子結構還是生物活性方面都具有獨特性，可能成為抗腫瘤新藥開發(fā)的重要來源。因此，在本實驗室前期研究基礎上，本論文利用熱液口嗜熱噬菌體GVE2感染其宿主菌Geobacillus sp.E263產生的次生代謝產物，篩選具有抗腫瘤轉移活性的化合物，并深入研究其抑制腫瘤細胞轉移的機制。我們從本實驗前期研究獲得的24種差異代謝產物中選取了6種結構已知的化合物（L-正亮氨酸、鄰氨基對甲苯酚、對羥基苯甲醇、色醇、腺嘌呤和安替比林），研究其對人胃癌和乳

10、腺癌細胞及相應正常細胞增殖、遷移、侵襲和粘附能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)L-正亮氨酸顯著抑制胃癌細胞HGC-27和乳腺癌細胞MDA-B-435的細胞遷移、侵襲和粘附，但對胃和乳腺正常細胞增殖沒有明顯的抑制作用，說明L-正亮氨酸對癌細胞具有較好的選擇性。通過對L-正亮氨酸結構類似物的活性測定，確定了L-正亮氨酸抑制腫瘤細胞轉移的活性基團。通過對L-正亮氨酸進行衍生化，得到了具有腫瘤細胞轉移抑制活性的衍生物(3S，6S)-3，6-二丁基哌嗪-2，5

11、-二酮。利用L-正亮氨酸耦聯(lián)溴化氰活化介質進行親和下拉試驗，結果發(fā)現(xiàn)L-正亮氨酸作用的靶蛋白是核內不均一核糖核蛋白hnRNPA2/B1。進一步研究顯示，L-正亮氨酸可能通過作用于核內不均一核糖核蛋白并上調E-cadherin的表達，抑制腫瘤細胞轉移。
　　本論文圍繞深海熱液口病毒與微生物之間的相互作用展開研究。首先，通過對東太平洋中脊、南大西洋和西南印度洋海隆深海熱液口細菌群落多樣性研究，拓展了對深海熱液口微生物群落結構的認識。其