蛋白質Z在肺腺癌生長與轉移中的功能研究.pdf

1、研究背景：
　　肺癌是一種肺部組織內(nèi)細胞生長失控的疾病，其發(fā)病率和死亡率增長很快。根據(jù)美國的最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)，肺癌目前是全球癌癥死因的第一名，約占全部惡性腫瘤的26％，對人群健康和生命威脅很大，尤其是肺腺癌初診時大多已是晚期，血行轉移較早，多伴血栓形成。肺癌的病因至今尚不完全明確。蛋白質Z（Protein Z,PZ）作為蛋白質Z依賴的蛋白酶抑制劑（Protein Z dependent protease inhibitor, ZPI）

2、的輔因子，主要在ZPI抑制FⅩa的過程中發(fā)揮間接抗凝作用，可以使ZPI對FⅩa的抑制作用增強1000倍以上。PZ缺乏時，抑制FXa作用下調，使凝血活性增強，從而可增加血栓形成的危險性。
　　我們前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)隨著惡性腫瘤病程進展，PZ血漿水平明顯下降，這可能是惡性腫瘤高凝狀態(tài)形成的一個新的機制。最新的研究發(fā)現(xiàn)PZ可以在乳腺癌組織、肺癌組織、結腸癌組織和胃癌組織中過表達或合成，認為PZ可能在腫瘤組織內(nèi)發(fā)揮抗凝血作用，從而可能影響

3、到腫瘤的血管新生、侵襲和轉移。為了探索PZ在惡性腫瘤細胞的過表達除了可能與惡性腫瘤血栓形成有關外，是否也和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移相關，我們選取了肺癌類型中最易早期轉移及血栓形成的肺腺癌作為研究對象來研究這一問題。
　　目的：
　　1.了解PZ蛋白及mRNA在肺腺癌的表達。
　　2.獲得 P Z蛋白在肺腺癌生長和轉移中發(fā)揮重要作用的實驗證據(jù)。
　　3.探討PZ在肺腺癌發(fā)病、進展、預后中的意義。
　　方法：

4、r>　　第一部分免疫組化方法檢測正常肺組織、肺腺癌組織PZ的表達
　　收集正常肺組織、肺腺癌組織、癌旁組織標本后，免疫組織化學方法分別檢測45例正常肺組織、45例肺腺癌組織及45例癌旁組織PZ的表達。完成統(tǒng)計分析，了解PZ蛋白在肺腺癌中的表達情況及其與性別、分化及分期的關系。
　　第二部分Western blot方法檢測肺腺癌組織、肺腺癌旁組織PZ蛋白的表達
　　實驗分2組，共45例癌旁組織和45例肺腺癌組織。每個樣品

5、收集完成后，液氮中浸置30分鐘，轉至-70℃冰箱保存。待全部樣品收集完成后，對組織標本進行裂解并用玻璃勻漿器勻漿，低溫超速離心提取組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度。最后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，進一步證實PZ蛋白在肺腺癌中的表達情況及其與性別、分化及分期的關系。
　　第三部分Western blot方法檢測正常支氣管細胞及肺腺癌細胞PZ蛋白的表達
　　培養(yǎng)人正常支氣管上皮細胞及肺腺癌細胞，取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化細胞，培養(yǎng)基中和，轉

6、移至離心管，低溫超速離心后棄上清，PBS液清洗沉淀，RIPA裂解液裂解，充分裂解后，低溫超速離心提取細胞蛋白。BCA法測定蛋白濃度，了解PZ蛋白是否在肺腺癌細胞高表達。
　　第四部分Real time-PCR方法檢測肺腺癌組織及癌旁組織的PZ mRNA表達情況
　　實驗分2組，5例正常肺組織和5例肺腺癌組織。-70℃冰箱取出標本，解凍，玻璃勻漿器勻漿，低溫超速離心提取組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度。最后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，進一

7、步證實PZ蛋白在肺腺癌中的表達情況及其與性別、分化及分期的關系。
　　第五部分Real time-PCR方法檢測正常支氣管細胞及肺腺癌細胞PZ基因mRNA的表達
　　實驗分2組：正常支氣管上皮細胞及肺腺癌細胞。培養(yǎng)正常支氣管上皮細胞及肺腺癌細胞，取對數(shù)生長期細胞，提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，RT-PCR儀檢測各細胞PZ基因mRNA的表達量，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，了解PZ mRNA在肺腺癌細胞中的表達情況。
　　結果：

8、r>　　第一部分PZ在正常肺組織、肺腺癌組織、肺腺癌旁正常組織的表達
　　1.PZ在肺腺癌組織中高表達，在癌旁組織和正常肺組織中不表達或低表達，PZ在巨噬細胞、腫瘤相關巨噬細胞（Tumor-associatedmacrophages,TAMs）和新生血管的內(nèi)皮細胞（Endothelial cells,ECs）中高表達。經(jīng)統(tǒng)計分析可見PZ表達積分隨腫瘤進展明顯增高（P<0.05）；另外，低分化組同中高分化組比較得出PZ表達顯著升高，

9、差異有統(tǒng)計學意義（P<0.0005）；不同性別對比，PZ表達無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　第二部分Western blot方法檢測肺腺癌組織、肺腺癌旁組織PZ蛋白的表達
　　同肺腺癌旁組織相比，肺腺癌組織中PZ表達明顯升高，且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.0003）；早、中、晚各組相互對比，經(jīng)統(tǒng)計分析可見PZ表達隨腫瘤進展明顯增高（P<0.05）；此外，低分化組同中高分化組比較得出PZ表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0

10、.0005）；不同性別對比，PZ表達無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　第三部分Western blot方法檢測正常支氣管細胞及肺腺癌細胞PZ蛋白的表達
　　A549、212102、GLC-82及16-HBE-T中PZ蛋白的表達各有差異，經(jīng)半定量密度分析得出PZ表達在A549、GLC-82呈高表達，在A549尤為突出，差異均有統(tǒng)計學意義
　　第四部分肺腺癌組織和人正常肺組織PZ mRNA表達情況
　　分別檢測5例

11、肺腺癌組織和5例正常肺組織PZ基因和管家基因GADPH表達情況。由于樣本量不足，數(shù)據(jù)離散程度大，無統(tǒng)計學意義，后續(xù)需進一步加大樣本量進行檢測。（P>0.05）。
　　第五部分正常支氣管細胞及肺腺癌細胞PZ蛋白及mRNA的表達情況
　　應用熒光定量 PCR儀器 SYBR方法分別檢測肺腺癌細胞 A549和正常細胞16-HBE PZ基因和管家基因GADPH表達情況，通過檢測得出，肺腺癌細胞A549 PZ基因 mRNA表達量與正常對

12、照組二者之間的差異無統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1.PZ蛋白在肺腺癌組中的表達明顯高于正常肺組織（癌旁組織），表明 PZ可能與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展相關。
　　2.PZ蛋白在中晚期組的表達明顯高于早期組，表明其表達可能與肺腺癌的分期相關，即肺腺癌越接近晚期，PZ蛋白表達可能越高。
　　3.PZ蛋白在低分化組的表達明顯高于中高分化組，表明其表達可能與肺腺癌的分化程度相關，即腫瘤的分化程度越低，PZ蛋白表達可能越高。<