基于多重PCR靶向測(cè)序的乳腺癌易感基因BRCA1-2全外顯子區(qū)位點(diǎn)變異檢測(cè).pdf

1、乳腺癌是女性中常見的一種癌癥，近年來(lái)中國(guó)乳腺癌的發(fā)生率和死亡率呈上升趨勢(shì)。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展受到遺傳、激素水平、生活習(xí)慣和環(huán)境等多種因素的影響，其中遺傳背景、年齡和性別是乳腺癌發(fā)生的高危因素，約5-10％的乳腺癌是遺傳性乳腺癌。與乳腺癌發(fā)生高度相關(guān)的易感基因主要是BRCA1和BRCA2基因，約15％的家族性乳腺癌與BRCA1/2基因突變相關(guān)。BRCA1/2基因是抑癌基因，能夠維持雙鏈DNA的穩(wěn)定性，BRCA1/2編碼區(qū)突變會(huì)升高患乳腺癌的

2、風(fēng)險(xiǎn)。基于多重PCR的靶向測(cè)序技術(shù)是一種高效、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的測(cè)序方案，利用該技術(shù)對(duì)疾病易感基因的突變檢測(cè)已經(jīng)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用?；谵D(zhuǎn)座酶的建庫(kù)試劑盒具有高效、省時(shí)、起始DNA需求量低等優(yōu)勢(shì)。本論文利用多重PCR靶向富集BRCA1/2外顯子并結(jié)合基于轉(zhuǎn)座酶的建庫(kù)試劑盒建庫(kù)，利用二代測(cè)序平臺(tái)Illumina Hiseq2500系統(tǒng)對(duì)該DNA文庫(kù)進(jìn)行突變位點(diǎn)檢測(cè)并對(duì)其測(cè)序結(jié)果進(jìn)行應(yīng)用分析，主要研究?jī)?nèi)容分為以下三個(gè)部分:
　　1、設(shè)計(jì)靶

3、向富集BRCA1/2全外顯子的多重PCR引物及多重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化。研究共設(shè)計(jì)了58對(duì)引物覆蓋BRCA1/2外顯子和剪接位點(diǎn)區(qū)域，其中BRCA1引物25對(duì)和BRCA2引物33對(duì)，分別覆蓋基因長(zhǎng)度17763bp和24383bp，擴(kuò)增子長(zhǎng)度在400-1500bp之間。BRCA1/2多重PCR反應(yīng)總體系均為25μL，包括2×Premix Ex Taq HS(TaKaRa)12.5μL，模板DNA5ng，BRCA1混合引物(每條1μM)1μL

4、或BRCA2混合引物（每條1μM）4μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，56℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)參數(shù)為22次，72℃終延伸10min。擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)，BRCA1產(chǎn)物濃度高于BRCA2產(chǎn)物。
　　2、NGS測(cè)序文庫(kù)制備及生物信息學(xué)分析。為了確定最優(yōu)的NGS文庫(kù)制備方法，利用多重PCR和基于轉(zhuǎn)座酶建庫(kù)的方法制備了四組不同的比對(duì)文庫(kù):1）BRCA1PCR文庫(kù)，2）BRCA2PCR文庫(kù)，3）BRCA1/

5、2PCR產(chǎn)物混合文庫(kù)及4）BRCA1/2引物混合PCR文庫(kù)（BRCA2∶BRCA1=4∶1，混合引物總量2pmol）。NGS測(cè)序及生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，這4種基于多重PCR靶向測(cè)序的方法，在1或2個(gè)多重PCR反應(yīng)中可以捕獲BRCA1和BRCA2所有外顯子。這4種文庫(kù)的30×平均覆蓋度分別為100％、100％、99.94％和100％。在這4種文庫(kù)中，BRCA2外顯子平均測(cè)序深度和捕獲效率均高于BRCA1外顯子。應(yīng)用多重PCR靶向測(cè)序的方

6、法對(duì)21例健康外周血全血樣本和2例乳腺癌腫瘤組織樣本的BRCA1/2外顯子進(jìn)行測(cè)序，共檢出25個(gè)SNPs位點(diǎn)（其中1個(gè)BRCA1c.T5102A突變未被報(bào)道過(guò)）。未發(fā)現(xiàn)小片段的插入和缺失。4種方法檢出的SNPs位點(diǎn)經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證為真。這種基于多重PCR靶向測(cè)序的方法能夠用于臨床樣本BRCA1/2突變檢測(cè)。
　　3、應(yīng)用基于多重PCR靶向測(cè)序的方法檢測(cè)乳腺癌樣本BRCA1和BRCA2基因全外顯子區(qū)變異。提取基因組DNA，應(yīng)用

7、方法3）和4）制備12個(gè)乳腺癌外周血白細(xì)胞樣本的NGS文庫(kù)，檢測(cè)BRCA1和BRCA2基因全外顯子區(qū)突變。高通量測(cè)序結(jié)果顯示BRCA1/2所有外顯子均被捕獲，共檢出24個(gè)突變，其中有1例BRCA1致病突變r(jià)s80357303，該易感突變被報(bào)道會(huì)增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)合21個(gè)健康樣本對(duì)照分析，共檢出30個(gè)SNPs，其中7個(gè)SNPs包括rs28897689、rs55919657、rs118093942、rs11571707和rs80359

8、065、rs80357303（致病突變）和未報(bào)道的BRCA1c.T5102A突變僅出現(xiàn)在乳腺癌樣本中，3個(gè)SNPs包括rs1800062、rs80359785和rs80357127僅出現(xiàn)在健康樣本中。SNPs致病性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，未報(bào)道的BRCA1c.T5102A突變?yōu)榱夹?，而rs80359065很可能是導(dǎo)致BRCA2蛋白有害突變。Sanger測(cè)序驗(yàn)證進(jìn)一步證實(shí)這種基于多重PCR靶向測(cè)序的方法在檢測(cè)BRCA1/2全外顯子區(qū)變異方面具有高的