半巢式全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)在診斷肺內(nèi)及肺外結(jié)核病應(yīng)用價(jià)值研究.pdf

1、研究目的：
　　2011年，WHO推薦使用GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)作為快速診斷活動(dòng)期肺結(jié)核及利福平耐藥的方法，GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)在涂陽(yáng)肺結(jié)核的敏感度高于95％，涂陰肺結(jié)核的敏感度高于55％[1]。本研究的目的是評(píng)價(jià)GeneXpertMTB/RIF試驗(yàn)在肺結(jié)核及肺外結(jié)核患者直接診斷結(jié)核分枝桿菌和利福平的耐藥性的應(yīng)用價(jià)值。
　　研究方法：
　　第一部分:本研究是在山東省胸科醫(yī)院開展的，是山

2、東省唯一的一個(gè)省級(jí)防治結(jié)核病和其它肺部疾病的醫(yī)院。山東省是中國(guó)第二大省份，擁有9千6百萬(wàn)的人口,其中59％的農(nóng)村人口。山東省每年新發(fā)病例約4萬(wàn)。本研究收集2013年7月到2014年6月在山東省胸科醫(yī)院住院治療的共506名疑似結(jié)核病患者的標(biāo)本，包括疑似肺結(jié)核患者229名（痰標(biāo)本229例），疑似肺外結(jié)核患者277名（101例腦脊液標(biāo)本，124例胸腔積液標(biāo)本，22例組織標(biāo)本，21例尿液標(biāo)本和9例腹腔積液標(biāo)本），每例疑似結(jié)核病患者取3份標(biāo)本，一

3、份采用熒光染色顯微鏡鏡檢;一份采用BACTECTMMGITTM960 Mycobacterial Detection System(BD，NJ，USA)進(jìn)行結(jié)核菌快速培養(yǎng);一份用于GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)。GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果及臨床診斷分別比較，評(píng)價(jià)GeneXpert MTB/RIF對(duì)痰液樣本及包括腦脊液、胸腔積液等肺外樣本中檢出結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異性。并以臨床診斷為

4、標(biāo)準(zhǔn)分別評(píng)估涂片熒光染色顯微鏡檢測(cè)、BACTECTM MGITTM960 MycobacterialDetection System結(jié)核菌快速培養(yǎng)、GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)及三種方法聯(lián)合使用診斷結(jié)核病患者的敏感度。臨床診斷結(jié)核病主要通過(guò)臨床癥狀，胸部影像學(xué)表現(xiàn)，陽(yáng)性的實(shí)驗(yàn)室檢查（涂片顯微鏡檢查，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)等）和經(jīng)過(guò)抗結(jié)核試驗(yàn)性治療好轉(zhuǎn)作為依據(jù)[3]。
　　第二部分:BAC

5、TECTM MGITTM960 Mycobacterial Detection System培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本經(jīng)涂片染色鏡檢確定為抗酸桿菌，使用結(jié)核分枝桿菌抗原MPT64試劑盒鑒定是否為結(jié)核分枝桿菌。經(jīng)鑒定為結(jié)核分枝桿菌的樣本，采用BACTECTM MGITTM960Mycobacterial Detection System藥敏試劑盒進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，主要包括2種一線抗結(jié)核藥物:異煙肼、利福平。使用標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv作為質(zhì)控菌株進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)

6、量控制。MGIT960液體藥敏結(jié)果與第一部分GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果中利福平的藥敏檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，評(píng)估GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)利福平耐藥的敏感度和特異性，及預(yù)測(cè)MDR-TB的敏感度和特異性;對(duì)于GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)與結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)(DST)檢測(cè)結(jié)果有差異的樣本提取DNA，應(yīng)用焦磷酸測(cè)序的方法確認(rèn)差異的菌株的基因型，評(píng)估GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)ropB基因突變的準(zhǔn)確性

7、。所有的檢測(cè)都在山東省胸科醫(yī)院漢光微生物實(shí)驗(yàn)室（通過(guò)IS015189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的結(jié)核病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室）內(nèi)進(jìn)行。
　　研究結(jié)果：
　　第一部分:229名疑似肺結(jié)核患者中，GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果為130例(56.8％)結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性，98例(42.8％)結(jié)核分枝桿菌陰性，還有1例不明確;結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為125例（54.6％)結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性，88例（38.4％)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陰性，10例（4.4％)

8、為非結(jié)核性分枝桿菌，6例（2.6％)為標(biāo)本污染;熒光染色涂片鏡檢結(jié)果為128例(55.9％)陽(yáng)性，101例(44.1％)陰性。GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的陽(yáng)性一致率為94.3％(k=0.885;95％ CI，0.824-0.946);GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)和熒光染色涂片鏡檢陽(yáng)性的一致率為75.1％(k=0.751;95％ CI，0.665-0.838)。
　　在277名疑似肺外結(jié)核患者

9、當(dāng)中， GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果為40例(14.4％)結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性，237例(85.6％)結(jié)核分枝桿菌陰性;結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果50例(18.1％)結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性，227例(81.9％)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陰性，未檢出非結(jié)核分枝桿菌;熒光染色涂片鏡檢結(jié)果只有11例(4.0％)陽(yáng)性，266例(96％)陰性。GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)兩種方法在尿液標(biāo)本中有較高的一致率(n=2;100％; k

10、=1.0)，在組織標(biāo)本中陽(yáng)性一致率比較低(n=11;54.6％，k=0.091)。共有210名疑似肺外結(jié)核患者被臨床診斷為活動(dòng)性結(jié)核病例，以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)、結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)、熒光染色涂片顯微鏡檢查及三者相結(jié)合的方法的敏感度分別是19.0％(40/210)、23.8％(50/210)、5.2％(11/210)和34.3％(72/210)。不同種類的標(biāo)本GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)的敏感

11、度相差比較大（12.3％-61.1％），但是GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)對(duì)于肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷特異性均為100％.
　　第二部分:121例肺結(jié)核和肺外結(jié)核分離菌株進(jìn)行了DST檢測(cè)。GeneXpertMTB/RIF檢測(cè)出21例利福平耐藥，DST檢測(cè)22例利福平耐藥，其中17例也存在異煙肼耐藥，即多重耐藥(MDR)， GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)和DST檢測(cè)利福平耐藥的一致率是92.6％(k=0.746和95％

12、 CI，0.588-0.903)。以DST作為標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)利福平耐藥的敏感度為77.2％和特異性為96.0％，在預(yù)測(cè)MDR-TB方面敏感度為76.5％(13/17)，特異性為96.2％(100/104)(Table3)。GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)和結(jié)核菌藥敏檢測(cè)利福平耐藥不一致的有9例，GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)利福平耐藥而DST檢測(cè)敏感有4例， GeneXpertMTB/

13、RIF試驗(yàn)檢測(cè)利福平敏感而DST檢測(cè)耐藥有5例，焦磷酸測(cè)序結(jié)果GeneXpertMTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)利福平耐藥的4例樣本存在基因突變， GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)利福平敏感的5例樣本均未檢測(cè)到突變，GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果與焦磷酸測(cè)序結(jié)果一致。
　　研究結(jié)論：
　　GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)對(duì)肺結(jié)核病的診斷有具有較好的敏感度和特異性，以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)診斷肺結(jié)核病的敏感度為6

14、7.7％，特異性為100％，以結(jié)核菌培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)診斷肺結(jié)核病的敏感度為96.8％，特異性93.8％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與陰性預(yù)測(cè)值都達(dá)到了95％以上。對(duì)于肺結(jié)核病患者來(lái)說(shuō)GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)檢測(cè)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，與結(jié)核菌培養(yǎng)的一致性高于涂片鏡檢，而且可以排除非結(jié)核分枝桿菌(NTM)感染，對(duì)于肺結(jié)核病的診斷具有很好的應(yīng)用價(jià)值。
　　對(duì)于肺外結(jié)核的病例研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的敏感度要高于GeneXpertMTB/RIF試驗(yàn)

15、(23.8％ vs.19％.0)，遠(yuǎn)高于涂片鏡檢(5.2％)，三種方法聯(lián)合使用敏感度可達(dá)到34.3％，表明GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)單獨(dú)用于診斷肺外結(jié)核病會(huì)導(dǎo)致檢出率偏低，容易漏診部分病人，同時(shí)進(jìn)行結(jié)核菌快速培養(yǎng)和涂片熒光染色鏡檢檢測(cè)，三種方法聯(lián)合使用才能有效診斷肺外結(jié)核，不至于導(dǎo)致誤診或漏診。不同的肺外樣本GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)敏感度相差較大，對(duì)于組織樣本GeneXpertMTB/RIF試驗(yàn)敏感度遠(yuǎn)高于其他

16、兩種方法，與其他兩種方法相比GeneXpertMTB/RIF試驗(yàn)更適合于組織樣本檢測(cè)。
　　BACTECTM MGITTM960 Mycobacterial Detection System藥敏實(shí)驗(yàn)和GeneXpertMTB/RIF檢測(cè)利福平藥敏的樣本共121例，其中MDR17例，占總數(shù)的14.05％，高于第五次全國(guó)流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告報(bào)道的全國(guó)平均水平6.8％[4]。其中GeneXpertMTB/RIF檢測(cè)利福平耐藥的為21例，其中

17、13例為MDR，檢測(cè)為敏感的100例，其中包括4例MGITTM960藥敏檢測(cè)為MDR的菌株。以MGITTM960藥敏作為金標(biāo)準(zhǔn)GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)利福平的敏感度為77.27％，特異性為95.96％，GeneXpert MTB/RIF試驗(yàn)檢出76.5％(13/17) MDR-TB，低于部分國(guó)家學(xué)者報(bào)道GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)的敏感度。有研究報(bào)道在結(jié)核病流行的國(guó)家混合型的結(jié)核分枝桿菌感染占結(jié)核病例的50％，病