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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:心肌梗死(MI,myocardial infarction)對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。MI后心室重構(gòu)的發(fā)生嚴(yán)重影響了MI患者的生活質(zhì)量。MI后心功能不全已成為患者死亡的主要原因。目前盡管MI的死亡率下降,但MI后心功能不全仍未改善,已成為家庭及社會(huì)沉重的負(fù)擔(dān)。心功能不全是各種心臟疾病的終末階段。藥物治療可以緩解病情,但是無法使受損的心肌細(xì)胞再生。要使心肌細(xì)胞再生乃至衰竭的心臟恢復(fù)功能仍是一項(xiàng)巨大的挑戰(zhàn)。干細(xì)胞治療對(duì)于逆轉(zhuǎn)終末期損傷心
2、臟是最有希望的治療方法。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs,mesenchymal stem cells)存在于多種成體組織內(nèi),骨髓是MSCs的主要來源。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs,bone marrow mesenchymalstem cells)可參與受損心肌的重建,可以提高左室射血分?jǐn)?shù),降低左心室收縮末期和舒張末期容積、減少梗死面積并改善左室重構(gòu)。由于MI后微環(huán)境的改變使BMSCs在梗死心肌中不能長(zhǎng)期存活從而限制了干細(xì)胞的修復(fù)能力。人們?cè)噲D
3、通過基因工程的方法來解決這一問題。基因工程是將外源性基因?qū)肽康募?xì)胞中,使得該細(xì)胞具備過表達(dá)或靜默表達(dá)某種基因的能力。對(duì)干細(xì)胞加以基因修飾,使干細(xì)胞具有更好的促血管再生、抗細(xì)胞凋亡、抗炎、修復(fù)心功能的作用。外源性基因?qū)肽康募?xì)胞中有病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。非病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低。目的基因只能實(shí)現(xiàn)瞬間表達(dá),容易引發(fā)免疫反應(yīng)和被機(jī)體所清除。本實(shí)驗(yàn)采用腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs,轉(zhuǎn)染效率高,無毒副作用。Bcl-2是具有明顯抑制凋亡作用的基因,
4、以Bcl-2修飾BMSCs可作為提高移植細(xì)胞存活率的手段。本研究目的在于觀察經(jīng)Bcl-2修飾的同種異體BMSCs移植對(duì)兔心梗后心功能不全模型心功能的影響。
方法:制備含目的基因Bcl-2的原始質(zhì)粒。將目的基因Bcl-2從原始質(zhì)粒上切下連接到pShuttle-CMV-EGFP重組穿梭載體。將驗(yàn)證正確的pShuttle-CMV-EGFP-Bcl-2轉(zhuǎn)移到pAdeno載體上,得到pAdeno-Bcl-2病毒質(zhì)粒。大量制備重組質(zhì)粒,共
5、轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,收集病毒(P1代病毒)。以P1代腺病毒感染293細(xì)胞,連續(xù)三代反復(fù)擴(kuò)增收集病毒,至P4代行病毒的大量擴(kuò)增。經(jīng)反復(fù)凍融后保存,于-80℃保存待用。采集3月齡兔脛骨骨髓,用密度梯度離心法和貼壁法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞至第九代。用帶綠色熒光蛋白標(biāo)記的空載體腺病毒及帶有Bcl-2基因的腺病毒分別轉(zhuǎn)染上述培養(yǎng)細(xì)胞。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支制作心功能不全模型。兩周后根據(jù)超聲心動(dòng)圖結(jié)果選取造模成功模型,即左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF,leftven
6、tricular ejection fraction)≤50%,并隨機(jī)分為Ad-EGFP-Bcl-2組(n=6)、Ad-EGFP組(n=6)和DMEM組(n=6)。開胸進(jìn)行細(xì)胞移植,Ad-EGFP-Bcl-2組移植Ad-EGFP-Bcl-2-BMSCs、Ad-EGFP組移植Ad-EGFP-BMSCs、DMEM組注入等量DMEM。4周后行心臟超聲檢查,測(cè)量LVEF、左室縮短率(FS,left ventricular fractional
7、shortening)、左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD,left ventricular end-diastolic diameter)、左室收縮末內(nèi)徑(LVESD,left ventricular end systolic diameter),并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)梗死邊緣區(qū)心肌組織Bcl-2的表達(dá)。分析心功能與Bcl-2的表達(dá)的相關(guān)性。HE染色觀察心肌病理改變,熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生存。
結(jié)果:
8、 1.Ad-Bcl2-GFP腺病毒滴度為2.5×1010PFU/ml;
2.采用密度梯度離心法和貼壁法成功培養(yǎng)出BMSCs,傳至十二代細(xì)胞狀態(tài)仍很好;
3.本實(shí)驗(yàn)采用第九代BMSCs,最佳MOI為500,感染36h后觀察到EGFP表達(dá),腺病毒轉(zhuǎn)染率100%;
4.成功制備兔心梗后心功能不全模型,造模后存活21只,2周后根據(jù)心臟彩超結(jié)果及造模成功判定標(biāo)準(zhǔn)(LVEF≤50%),共有18只造模成功。
9、5.Ad-EGFP-Bcl-2組和Ad-EGFP組與DMEM組相比,心功能改善均優(yōu)于DMEM組,Ad-EGFP-Bcl-2組改善更明顯。EF值[(68.222±3.763)%,(57.056±3.555)%,(47.389±5.567)%,P=0.000], EDD值[(9.556±0.981)mm,(11.611±0.828) mm,(13.389±1.569) mm,P=0.000], ESD值[(5.722±0.647)mm,(7
10、.889±0.544) mm,(9.889±0.749)mm, P=0.000], FS值[(39.167±3.817)%,(31.833±2.492)%,(25.778±3.851)%,P=0.000];
6.心肌梗死邊緣區(qū)Bcl-2表達(dá)在Ad-EGFP-Bcl-2組明顯提高(1.015±0.115,0.358±0.057,0.090±0.065,P=0.000),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
7.EF與Bcl-2表達(dá)呈正
11、相關(guān),相關(guān)系數(shù)R為0.940,決定系數(shù)R2為0.883,回歸方程及所有系數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,回歸方程為Y=46.664+22.329X;
8.移植細(xì)胞存活率提高了,在熒光顯微鏡下Ad-EGFP-Bcl-2組BMSCs數(shù)目是Ad-EGFP組的1.5倍;
9.Ad-EGFP-Bcl-2組和Ad-EGFP組與DMEM組相比,病理改變較輕,Ad-EGFP-Bcl-2組效果更好。
結(jié)論:間充質(zhì)干細(xì)胞易于分離并且大量培養(yǎng)
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