松果菊苷抑制蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化及對(duì)UVB所致皮膚損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：
　　1.體外孵育HEWL及Aβ建立蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化模型，研究ECH對(duì)其的影響。
　　2.建立UVB照射HaCaT細(xì)胞損傷模型，評(píng)價(jià)ECH對(duì)UVB所致HaCaT細(xì)胞損傷的保護(hù)作用并探討其可能的作用機(jī)制。
　　3.制備ECH乳膏劑并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。
　　4.建立UVB照射 Balb/c小鼠皮膚損傷模型，初步研究ECH對(duì)UVB所致小鼠皮膚損傷的保護(hù)作用。
　　方法：
　　一、ECH對(duì)蛋白質(zhì)淀

2、粉樣纖維化的抑制作用研究
　　1.將HEWL與不同濃度的ECH，在酸性條件下，55°C恒溫水浴12天形成淀粉樣纖維沉淀。通過ThT熒光探針、CR染料和ANS熒光探針檢測(cè)HEWL在淀粉樣纖維化過程中β-折疊結(jié)構(gòu)的變化及表面疏水區(qū)域的暴露情況； TEM觀察HEWL形態(tài)； CD譜檢測(cè)HEWL二級(jí)結(jié)構(gòu)；MTT法和紅細(xì)胞溶血性試驗(yàn)檢測(cè)HEWL對(duì)神經(jīng)細(xì)胞PC12活性及溶血性的影響。
　　2.將濃度為500μM的ECH分別于孵育的第0、3

3、、7、11天加入HEWL樣品中，并對(duì)其進(jìn)行ThT和ANS熒光探針、CR染料、CD譜、TEM檢測(cè)，及細(xì)胞活性和紅細(xì)胞溶血性試驗(yàn)。
　　3.以Vc為陽(yáng)性對(duì)照，通過DPP H和?HO自由基清除試驗(yàn)，測(cè)定不同濃度ECH的抗氧化活性。
　　4.將Aβ25-35于37°C恒溫水浴48 h,以形成淀粉樣纖維。將形成的纖維和不同濃度的ECH共同作用于PC12細(xì)胞，MTT檢測(cè)細(xì)胞活性，DCFH-DA熒光探針標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

4、　　二、ECH對(duì)UVB所致HaCaT細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究
　　1.細(xì)胞定量接種孵育后，給予不同劑量的UVB（25、50、100、300、500 mJ/cm2）照射，通過MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活性，篩選出致HaCaT損傷的最佳UVB照射劑量。
　　2.將細(xì)胞分為6組：control；50μM ECH；UVB；25μM ECH+UVB；50μM ECH+UVB；100μM EC H+UVB。加藥組分別在UVB照射前給予不同濃度（

5、25、50、100μM）的ECH，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行UVB照射，并檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。
　　3. MTT法和LDH含量測(cè)定評(píng)價(jià)細(xì)胞活性；測(cè)定細(xì)胞中SOD、CAT、GSH-Px酶活性和MDA含量；流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)8-OHdG含量；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞DNA碎片化；TUN EL法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；免疫印跡法檢測(cè)8-OHdG、ATR、C hk1、p53、Caspase-3、PA

6、RP、XPA蛋白的表達(dá)。
　　三、ECH乳膏劑的制備工藝與質(zhì)量評(píng)價(jià)
　　1.以單硬脂酸甘油酯、液體石蠟、白凡士林、氮酮的用量為考察因素，用正交試驗(yàn)的方法，以制劑的外觀性狀，延展性和粘稠度，離心試驗(yàn)，高溫、低溫、室溫穩(wěn)定性試驗(yàn)為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，篩選優(yōu)化處方。
　　2.按照上述篩選的最優(yōu)處方工藝制備ECH乳膏劑，采用紫外分光光度法測(cè)定乳膏劑中ECH的含量。
　　四、ECH對(duì)UVB所致小鼠皮膚損傷的保護(hù)作用研究<

7、br>　　1.按工藝流程將ECH制成O/W型外用乳膏，ECH載藥量為0.5％、1%、5%。
　　2.將背部已脫毛的Balb/c小鼠隨機(jī)分為6組，10只/組：control；UVB；vehicle+UVB；0.5%ECH+UVB；1% ECH+UVB；5% ECH+UVB。
　　3.給藥組分別在給藥30 min后接受UVB照射，累積照射強(qiáng)度為1956 mJ/cm2。
　　4.末次照射24 h后，戊巴比妥鈉注射處死小鼠，取

8、背部皮膚進(jìn)行皮膚水腫檢測(cè)；H&E染色；免疫組化法檢測(cè)皮膚8-OHdG的表達(dá)；生化分析方法檢測(cè)SOD、CAT、GSH-Px酶活性和MDA含量。
　　結(jié)果：
　　一、ECH對(duì)蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化的抑制作用研究
　　1. ThT熒光探針、CR染料法及 ANS熒光探針法檢測(cè)結(jié)果顯示，孵育12天后，與HEWL組相比，HEWL+ECH各組的ThT、ANS熒光強(qiáng)度和CR紫外吸光度顯著降低；TEM觀察發(fā)現(xiàn)，HEWL+ECH組的纖維比HE

9、WL組更細(xì)更短更少；CD譜分析發(fā)現(xiàn)，單純HEWL孵育的第0天，在208 nm和222 nm處分別有一個(gè)吸收峰，而孵育第12天在220 nm處出現(xiàn)一強(qiáng)的吸收峰，而ECH的加入使得220 nm處吸收峰強(qiáng)度減小，208 nm處的吸收峰強(qiáng)度增大；M TT及紅細(xì)胞溶血性檢測(cè)結(jié)果顯示，HEWL+ECH各組的細(xì)胞活性更高，紅細(xì)胞溶血性更小。
　　2.在孵育的第0、3、7、11天不同時(shí)間點(diǎn)加入ECH都可在一定程度上抑制淀粉樣纖維的形成，同時(shí)可將已

10、形成的淀粉樣纖維降解為無定型聚集體；且加入的時(shí)間越早，ECH的作用越強(qiáng)。
　　3. DPPH及?HO自由基清除活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，ECH對(duì)DPPH的清除活性高于?HO，且其對(duì)二者的清除能力都弱于Vc。
　　4. M T T及R O S檢測(cè)結(jié)果顯示E C H能改善Aβ25-35誘導(dǎo)的P C12細(xì)胞活性的降低，抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，且這種作用與ECH的濃度成正比。
　　二、ECH對(duì)UVB所致HaCaT細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

11、r>　　1.不同強(qiáng)度（25、50、100、300、500 mJ/cm2）的 UVB照射都可在一定程度上使HaCaT細(xì)胞的活性降低，且強(qiáng)度為300 mJ/cm2的UVB使細(xì)胞活性降低約50%。
　　2.與UVB組相比，不同濃度的EC H都可阻止UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞活性降低；提高細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px酶活性，降低MDA含量；降低細(xì)胞內(nèi)ROS和8-OHdG水平；阻止UVB造成的細(xì)胞DNA碎片化；抑制HaCaT細(xì)胞凋亡；

12、下調(diào)8-OHdG、p-ATR、p-Chk1（Ser345）、p-p53（Ser15）、cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白的表達(dá)，上調(diào)XPA蛋白的表達(dá)，且這些作用的強(qiáng)度與EC H濃度成正比。
　　三、ECH乳膏劑的制備工藝與質(zhì)量評(píng)價(jià)
　　1.篩選優(yōu)化得到的最佳處方配比為ECH5%、硬脂酸10%、單硬脂酸甘油酯5%、液體石蠟5%、白凡士林10%、三乙醇胺4%、氮酮3%、尼泊金乙酯0.1%。
　

13、　2. ECH在1~20μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（r=0.9990），平均回收率為102.2%（RSD=1.4%），乳膏劑穩(wěn)定性良好。
　　四、ECH對(duì)UVB所致Balb/c小鼠皮膚損傷的保護(hù)作用研究
　　與UV B組相比，不同載藥量的EC H乳膏都可改善UV B造成的小鼠皮膚水腫、粗糙、紅腫、潰爛以及表皮增厚；降低皮膚組織中8-OHdG的過量表達(dá)；升高SOD、CAT和GSH-Px酶活力，降低MDA含量。
　

14、　結(jié)論：
　　1. ECH對(duì)HEWL淀粉樣纖維的形成具有一定的抑制作用，可降低HEWL二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)向β-折疊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化，減少疏水區(qū)域的暴露，減弱HEWL造成的細(xì)胞毒性和紅細(xì)胞溶血性；降低Aβ引起的PC12細(xì)胞的損傷。且這些作用的發(fā)揮可能與其顯著的抗氧化活性有關(guān)。
　　2. ECH乳膏劑制備工藝簡(jiǎn)單，含量均一，易于涂抹，手感舒適，細(xì)膩，無油膩感，質(zhì)量控制方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，可靠。
　　3. UVB可造成小鼠皮膚和H