乙型肝炎病毒rtA181T、rtN238T、基因型及預(yù)存耐藥變異對(duì)臨床核苷（酸）類藥物耐藥影響的研究.pdf

1、背景：我國(guó)目前有9300萬(wàn)慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者，每年有30萬(wàn)人死于乙肝相關(guān)肝病。目前中國(guó)已上市的抗HBV藥核苷（酸）類(nucleos(t)itde analogs，NA)類藥物包括核苷類的拉米夫定（Lamivudine，LAM）、替比夫定(Telbivudine，LdT)、恩替卡韋(Entecavir，ETV)和核苷酸類的阿德福韋(Adefovir，ADV)、替諾福韋(Tenfovir，

2、TDF)。NA藥物能夠有效抑制病毒，副作用小，但長(zhǎng)期治療過(guò)程中病毒易產(chǎn)生耐藥變異。HBV耐藥變異可引起病毒學(xué)突破和生化學(xué)突破，是抗HBV治療失敗或療效不佳的重要原因，可以造成肝炎再發(fā)和肝病進(jìn)展，甚至可引起暴發(fā)性肝衰竭導(dǎo)致患者死亡。
　　本研究針對(duì)臨床上HBV耐藥變異中存在的難點(diǎn)和熱點(diǎn)，綜合利用臨床大樣本測(cè)序、動(dòng)態(tài)隨訪、克隆測(cè)序、質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞評(píng)價(jià)復(fù)制力和表型耐藥特性等多種研究手段，重點(diǎn)對(duì)以往研究結(jié)果不夠明確的HBV rtA181

3、T、rtN238T和HBV基因型對(duì)耐藥的影響進(jìn)行了分析;同時(shí)，對(duì)以往爭(zhēng)議較大的NA未治療患者的預(yù)存耐藥變異進(jìn)行了研究。結(jié)果可以加深對(duì)我國(guó)臨床實(shí)踐中的HBV耐藥變異情況的了解，向臨床優(yōu)化管理耐藥變異提供重要依據(jù)。
　　目的：本研究旨在:①研究較大樣本量NA經(jīng)治慢性HBV感染患者rtA181T/sW172的臨床流行情況，明確rtA181T變異的發(fā)生特點(diǎn)與臨床意義。
　?、诜治鯝DV非經(jīng)典耐藥變異的臨床流行情況，對(duì)其中檢出率較高的

4、HBV變異毒株進(jìn)行動(dòng)態(tài)克隆分析和袁型耐藥檢測(cè)。
　?、坳U明我國(guó)流行的HBV B基因型和C基因型病毒是否與耐藥變異發(fā)生相關(guān)。
　?、苊鞔_NA未治療患者預(yù)存耐藥變異的臨床檢出率，揭示預(yù)存耐藥變異毒株的表型耐藥特性和臨床演變規(guī)律。
　　方法：(1)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)直接測(cè)序法對(duì)18419例慢性HBV感染患者進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase，

5、RT)基因測(cè)序，明確rtA181T/sW172各種變異形式所占比例，分析不同rtA181T/sW172變異形式患者HBV DNA和表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)水平的差異。
　　(2)從第一部分病例中選取11143例單獨(dú)應(yīng)用NA藥物治療或未應(yīng)用NA治療的慢性HBV感染者，分析其7種ADV非經(jīng)典耐藥位點(diǎn)的變異情況，即rtV84M，rtS85A，rtV214A，rtQ215S，rtI23

6、3V，rtP237H和rtN238T;對(duì)1例rtN238T患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)克隆測(cè)序分析;構(gòu)建含有rtN238T+A181V、rtN238T、rtA181V和無(wú)耐藥變異野生株的pTriEx-1.1-HBV載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測(cè)上清中的病毒復(fù)制中單位本以評(píng)價(jià)各病毒株的復(fù)制力和對(duì)核苷（酸）類似物的耐藥性。
　　(3)從第一部分病例中選取13847例經(jīng)歷過(guò)NA治療的非肝癌(hepatocacinoma，HCC)患者，應(yīng)用Mega6

7、軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)確定病毒基因型，分析不同基因型病毒中各種耐藥變異的分布情況。
　　(4)從第一部分病例中選取845例未經(jīng)NA治療的住院患者，確定原發(fā)性耐藥變異的檢出率;構(gòu)建rtL80I+M204I、rtL180M+M204I和rtA181V+N236T3種變異株的pTriEx-1.1-HBV表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行復(fù)制力和表型耐藥分析;克隆測(cè)序分析1例預(yù)耐藥變異患者體內(nèi)病毒的動(dòng)態(tài)演變情況。
　　結(jié)果：(1)共檢出750例(4.1％

8、) rtA181T變異，其發(fā)生率呈逐年升高的趨勢(shì)。發(fā)現(xiàn)rtA181T對(duì)應(yīng)sW172共有9種變異形式，其中166例(22.1％)為sW172*單獨(dú)存在，525例(69.9％)為sW172終止變異與野生株共存;不同sW172變異形式患者的HBV DNA水平和HBsAg水平并無(wú)差異。
　　(2)在7種ADV非經(jīng)典耐藥變異中，rtN238T變異檢出率在ADV治療患者中顯著高于應(yīng)用其它NA藥物治療的患者。對(duì)1例患者動(dòng)態(tài)克隆分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)生rt

9、N238T+A181V變異后，應(yīng)用ETV治療33個(gè)月，患者體內(nèi)病毒全部轉(zhuǎn)變?yōu)橐吧辍２《局陱?fù)制力檢測(cè)結(jié)果顯示rtN238T+A181V顯著高于rtA181V(P＜0.01)。表型耐藥分析顯示，與野生株比較，rtN238T+A181V和rtA181V變異株對(duì)ADV敏感性顯著下降，rtN238T變異株對(duì)ADV敏感，但rtN238T+A181V變異株較rtA181V株的復(fù)制力顯著提高。
　　(3)LAM相關(guān)耐藥變異發(fā)生率為HBV/C型顯

10、著高于HBV/B型(31.67％vs.25.26％)。整體來(lái)看ADV耐藥變異在HBV/C和HBV/B型之間并無(wú)差異(8.96％vs.9.87％);具體來(lái)看，rtA181V的發(fā)生率為HBV/C型高于HBV/B型(5.29％ vs.1.36％)，但rtN236T變異則相反(2.70％ vs.HBV/B6.54％)。ETV耐藥變異也有類似的現(xiàn)象，整體來(lái)看ETV耐藥變異在HBV/C和HBV/B型之間并無(wú)差異(4.32％vs.3.62％);具體來(lái)

11、看,rtM204V/I+rt184/202的發(fā)生率為HBV/C型高于HBV/B型(3.66％ vs.2.16％),但rtM204V/I+rt250變異則相反(0.67％ vs.1.46％)。多重耐藥變異發(fā)生率也為HBV/C型顯著高于HBV/B型(0.83％ vs.0.35％)，主要變異形式是rtM204V/I+rtA181V(0.72％ vs.0.30％)。
　　(4)共有17例(2.01％) NA未用藥患者檢出原發(fā)耐藥變異，直序

12、法和克隆測(cè)序法結(jié)果顯示所有患者均為耐藥變異株與野生株共存。通過(guò)克隆測(cè)序共發(fā)現(xiàn)了13種耐藥變異株，包括rtL80I+M204I，rtL80I+M204V，rtL180M+M204I，rtL180M+M204V, rtM204I, rtM204V, rtL80I+L180M+M204I,rtL80I+L180M+M204V, rtA181V, rtA181V+M204I, rtA181T+N236T,rtA181V+N236T，and rt

13、N236T。表型耐藥分析顯示2種LAM預(yù)存耐藥變異株rtL80I+M204I和rtL180M+M204V與野生株相比，對(duì)LAM的耐藥倍數(shù)都大于1000;1種ADV預(yù)存耐藥變異株rtA181V+N236T對(duì)ADV的耐藥倍數(shù)為15.4。動(dòng)態(tài)隨訪發(fā)現(xiàn)，預(yù)存耐藥變異rtM204I在ETV治療后在病毒池中的比例上升(20％→85％)。
　　結(jié)論：rtA181T變異株在臨床患者中常與rt181非變異株共存，單獨(dú)出現(xiàn)該變異未對(duì)HBsAg和HBV