急性脊髓損傷脊髓組織、血漿和腦脊液代謝組學(xué)平行研究.pdf

1、脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種高致殘率疾病，涉及細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激和免疫-內(nèi)分泌等多個(gè)病理機(jī)制[1-3]，其病理過程的復(fù)雜性不僅取決于初始的機(jī)械損傷，更取決于缺血、缺氧、自由基形成、興奮性毒性等繼發(fā)損傷。目前對(duì)于脊髓損傷的治療尚缺乏有效手段，繼發(fā)損傷機(jī)制尚未完全明確，脊髓損傷后許多血清生化指標(biāo)發(fā)生變化，但卻很難發(fā)現(xiàn)特征性生物標(biāo)志物[1,2,4]。無法對(duì)脊髓損傷嚴(yán)重程度進(jìn)行準(zhǔn)確判斷和預(yù)測。
　　代謝組

2、學(xué)(metabolomics)是效仿基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思想，對(duì)生物樣本所有代謝物進(jìn)行定量分析，并尋找代謝物與生理刺激、遺傳修飾、病理生理變化相對(duì)關(guān)系的研究方式[5,6]，是系統(tǒng)生物學(xué)重要組成部分。其高通量鑒定、定量代謝物的方法為研究脊髓損傷所涉及的復(fù)雜的代謝途徑和大量的代謝產(chǎn)物?供了有效手段。近年來已有學(xué)者應(yīng)用不同的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)脊髓損傷后患者或模式動(dòng)物生物樣本進(jìn)行分析，建立了相應(yīng)的代謝組學(xué)模型，能夠?qū)Σ煌瑩p傷程度的脊髓損傷進(jìn)行

3、區(qū)分，但大多數(shù)學(xué)者均采用單一生物標(biāo)本研究策略，篩選潛在標(biāo)志物以及可能涉及的病理生理過程，尚無對(duì)體液標(biāo)本與脊髓組織進(jìn)行橫向研究，體液標(biāo)本是否能夠真實(shí)反映損傷后脊髓組織代謝改變以及不同生物樣本間代謝相關(guān)關(guān)系都尚未明確。
　　研究目的：
　　本研究擬在建立大鼠脊髓損傷模型的基礎(chǔ)上，運(yùn)用GC-MS代謝指紋技術(shù)對(duì)脊髓損傷模型動(dòng)物的血漿、腦脊液和脊髓組織3類生物標(biāo)本進(jìn)行非靶向分析，研究脊髓損傷后不同生物樣本中代謝改變及相關(guān)關(guān)系。建立獼猴

4、脊髓全橫斷損傷模型，驗(yàn)證血漿（血清）生物樣本在脊髓損傷代謝組學(xué)研究中的可靠性和穩(wěn)定性。
　　研究方法：
　　1.大鼠脊髓損傷模型的建立選用成年健康SD大鼠60只隨機(jī)分為正常對(duì)照組、6小時(shí)組、24小時(shí)組以及72小時(shí)組，每組15只。損傷組應(yīng)用NYU脊髓損傷模型打擊器建立T9節(jié)段MASCIS脊髓損傷模型，打擊桿重量10g，初始高度25mm。通過建立模型動(dòng)物質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)模型質(zhì)量，符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)的模型動(dòng)物用以后續(xù)研究。
　

5、　2.生物標(biāo)本獲取脊髓損傷大鼠麻醉后，將頭部固定于立體定向架，應(yīng)用1ml注射器連接27G頭皮針行枕大池穿刺，緩慢抽取腦脊液，量應(yīng)大于100μl，放入 EP管中儲(chǔ)存。采血針于胸前心尖部行心臟穿刺，成功后連接肝素鋰抗凝真空采血管采集動(dòng)脈血2ml，靜置10分鐘后離心取血漿。解剖暴露脊髓，獲取打擊中心兩側(cè)各1cm內(nèi)脊髓組織，置于凍存管內(nèi)放入液氮中速凍。所有標(biāo)本-80℃儲(chǔ)存?zhèn)錂z。建立生物樣本質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)所獲取生物標(biāo)本進(jìn)行評(píng)估，因后續(xù)研究需進(jìn)行

6、不同生物樣本代謝相關(guān)分析，來源于同一動(dòng)物的所有標(biāo)本如有一種類型標(biāo)本出現(xiàn)不合格則該動(dòng)物所有標(biāo)本均需廢棄。
　　3.代謝組學(xué)分析對(duì)獲取的脊髓損傷大鼠生物標(biāo)本進(jìn)行衍生化處理，再通過氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行分析，得到質(zhì)譜譜圖，通過峰識(shí)別、峰過濾、峰對(duì)齊處理后獲得質(zhì)核比、保留時(shí)間、峰面積及Fisher率等GC-MS原始數(shù)據(jù)。通過SIMCA-P軟件對(duì)其進(jìn)行多維數(shù)據(jù)分析，排除異常標(biāo)本，查找代謝差異物，鑒定脊髓損傷相關(guān)代謝通路。
　　4.不

7、同生物標(biāo)本間代謝相關(guān)分析將譜峰數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)室自建標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜庫進(jìn)行對(duì)比，指認(rèn)代謝物，對(duì)各組織標(biāo)本進(jìn)行靶向代謝組學(xué)分析，橫向?qū)Ρ炔⒑Y選出體液與脊髓組織中均受脊髓損傷影響的共同代謝通路，對(duì)通路中關(guān)鍵差異代謝物進(jìn)行相關(guān)分析，以考察體液作為脊髓損傷代謝組學(xué)分析標(biāo)本的可靠性與相關(guān)性。
　　5.脊髓損傷獼猴血清代謝組學(xué)分析通過建立獼猴脊髓損傷動(dòng)物模型獲取損傷前、損傷后3小時(shí)以及損傷后3天的血清標(biāo)本，應(yīng)用GC-MS非靶向代謝指紋技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析，查

8、找差異代謝物及脊髓損傷相關(guān)代謝通路，并進(jìn)一步與脊髓損傷大鼠血漿標(biāo)本代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，以評(píng)價(jià)血漿（血清）作為脊髓損傷代謝組學(xué)分析標(biāo)本的潛力與可靠性。
　　研究結(jié)果：
　　每組隨機(jī)選取12套共48套生物標(biāo)本用于GC-MS分析，血漿標(biāo)本獲得譜峰478個(gè)，通過PCA模型排除異常標(biāo)本3個(gè)，應(yīng)用OPLS-DA模型及組間比較篩選差異代謝物34種，鑒定脊髓損傷相關(guān)代謝通路6條；腦脊液標(biāo)本獲取譜峰359個(gè)，通過PCA模型排除異常標(biāo)本2個(gè)，應(yīng)用

9、OPLS-DA模型及組間比較篩選差異代謝物20種，鑒定脊髓損傷相關(guān)代謝通路2條；脊髓組織標(biāo)本獲取譜峰673個(gè)，應(yīng)用OPLS-DA模型及組間比較篩選差異代謝物40種，鑒定脊髓損傷相關(guān)代謝通路14條。
　　組織間代謝組學(xué)平行分析顯示：血漿與脊髓組織共有指認(rèn)代謝物占脊髓指認(rèn)代謝物的88.5％，腦脊液與脊髓組織共有指認(rèn)代謝物占脊髓指認(rèn)代謝物的75.4%。血漿與脊髓組織共有的受影響代謝通路占脊髓組織調(diào)整通路的42.9%；腦脊液與脊髓組織共有

10、的受影響代謝通路占脊髓組織調(diào)整通路的23.8%。
　　丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝在本研究脊髓損傷大鼠各種標(biāo)本中均顯著改變，其關(guān)鍵代謝物丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、甘氨酸和絲氨酸在大多標(biāo)本中成為顯著差異代謝物。
　　對(duì)5只脊髓全橫斷損傷獼猴脊髓損傷前后3時(shí)間點(diǎn)血清標(biāo)本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，篩選并鑒定出受脊髓損傷影響顯著改變的代謝通路14條，其包含所有前述大鼠血漿脊髓損傷相關(guān)代謝通路。

11、
　　研究結(jié)論：
　　體液或脊髓組織均可單獨(dú)應(yīng)用于脊髓損傷代謝組學(xué)研究，因選取的標(biāo)本不同得出的差異代謝物與受脊髓損傷影響的代謝通路在數(shù)量和種類上不盡相同，脊髓組織代謝改變更直接的反映了損傷局部病理生理變化，體液代謝改變在部分反映脊髓損傷局部代謝特征的同時(shí)還能同時(shí)反映出整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)甚至生物體應(yīng)對(duì)損傷的代謝改變。
　　血漿（血清）與脊髓組織代謝相關(guān)程度更高，反應(yīng)靈敏，雖然易受機(jī)體其它因素影響，但仍能表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，適合

12、進(jìn)行脊髓損傷程度代謝生物標(biāo)志物的篩選。腦脊液與脊髓組織代謝相關(guān)程度相對(duì)較低、反應(yīng)滯后，但其相對(duì)封閉、保守、穩(wěn)定的特點(diǎn)更易于準(zhǔn)確反映脊髓損傷后脊髓局部長時(shí)間段代謝變化，適合用于脊髓損傷預(yù)后預(yù)測的代謝生物標(biāo)志物篩選。脊髓損傷組織的代謝變化直接反映了損傷局部代謝特征，適合進(jìn)行病理生理及損傷機(jī)制代謝組學(xué)研究。
　　在研究中我們還發(fā)現(xiàn)甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，丙氨酸，天門冬氨酸和谷氨酸代謝兩條代謝通路在脊髓損傷后不同生物樣本中均顯著的改變