糖基轉(zhuǎn)移酶基因β3GnT8和β3GnT2在CD147誘導(dǎo)MMPs表達(dá)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用.pdf

1、目的:研究糖基轉(zhuǎn)移酶基因（β3GnT8和β3GnT2）在CD147誘導(dǎo)MMPs表達(dá)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用;研究糖基轉(zhuǎn)移酶基因（β3GnT8和β3GnT2）催化合成的多聚乳糖胺糖鏈和細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子CD147在人胃癌和人膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)及其臨床意義;研究60Co-γ輻照對腫瘤細(xì)胞中糖基轉(zhuǎn)移酶和多聚乳糖胺糖鏈變化的影響。
　　 方法:(1)將β3GnT8 RNA干擾載體pSilenCircle-T8Si、對照載體pSi

2、lenCircle-T8Scr、β3GnT8和β3GnT2真核正義表達(dá)載體pEGFP-C1-T8S與pEGFP-C1-T2S及空載體pEGFP-C1通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染三種腫瘤細(xì)胞株（人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株LN229和人胃癌細(xì)胞株SGC-7901），并通過G418篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株。(2)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)入熒光載體的細(xì)胞株，RT-PCR和West blotting檢測β3GnT8和β3GnT2基因水平和蛋白水平的表達(dá)，

3、鑒定轉(zhuǎn)染效果。(3)流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光實驗分析G418篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株中，β3GnT8和β3GnT2基因水平和蛋白水平表達(dá)變化的同時，細(xì)胞表面多聚乳糖胺糖鏈表達(dá)變化。(4)下調(diào)糖基轉(zhuǎn)移酶基因β3GnT8的在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平，以及采用衣霉素和3’-疊氮胸腺嘧啶處理腫瘤細(xì)胞株，Western blotting監(jiān)測HG-CD147在腫瘤細(xì)胞株的表達(dá)變化，從而分析糖基轉(zhuǎn)移酶基因β3GnT8、衣霉素和3’-疊氮胸腺嘧啶對HG-CD147蛋白

4、水平表達(dá)的影響。(5)RT-PCR檢測衣霉素對MMP-2表達(dá)的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測衣霉素對細(xì)胞周期的影響。(6)采用STRING數(shù)據(jù)庫分析CD147和MMPs相互作用關(guān)系以及CD147和MMPs三維結(jié)構(gòu)模型。(7)在已制作腫瘤組織芯片，檢測腫瘤組織芯片中多聚乳糖胺糖鏈和CD147的表達(dá)。(8)60Co-γ輻照腫瘤細(xì)胞后，Western blotting分析糖基轉(zhuǎn)移酶的變化，流式細(xì)胞術(shù)分析多聚乳糖胺糖鏈的變化。
　　 結(jié)果:(1)

5、通過熒光顯微鏡觀察、RT-PCR和Western blotting檢測，載體成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。(2)流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光實驗檢測發(fā)現(xiàn)，上調(diào)β3GnT8的表達(dá)，則多聚乳糖胺糖鏈結(jié)構(gòu)表達(dá)量增多;下調(diào)β3GnT8的表達(dá)，則多聚乳糖胺糖鏈結(jié)構(gòu)減少。(3) Western blotting分析表明:①CD147在U251和SGC-7901細(xì)胞中，CD147含有HG-CD147和LG-CD147兩種結(jié)構(gòu);②衣霉素可以誘導(dǎo)在U251和

6、SGC-7901細(xì)胞產(chǎn)生一條沒有糖基化的CD147片段;③在LN229和SGC-7901細(xì)胞中，下調(diào)β3GnT8表達(dá)，HG-CD147蛋白水平降低;④隨著3’-疊氮胸腺嘧啶濃度逐漸增加，HG-CD147蛋白水平表達(dá)量逐漸降低。(4) RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過衣霉素處理后，與對照組相比，MMP-2幾乎不表達(dá)。(5)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期實驗發(fā)現(xiàn)衣霉素主要有規(guī)律地作用于細(xì)胞周期中的G1期，隨著衣霉素濃度的逐漸增高，％G1的值也逐漸增多。(

7、6)采用STRING數(shù)據(jù)庫分析表明，CD147與MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-11和MMP-14都具有相互作用，CD147具有3個N-連接的糖基化位點(Asn160、Asn268、Asn302)。(7)成功制作人胃癌組織、癌旁非腫瘤胃組織以及人膠質(zhì)瘤組織芯片。(8)在胃癌中多聚乳糖胺糖鏈的表達(dá)要強于正常胃粘膜上皮細(xì)胞，在彌漫型胃癌中多聚乳糖胺糖鏈的表達(dá)要強于腸型胃癌。由人膠質(zhì)瘤組織芯片結(jié)果看出，人膠

8、質(zhì)瘤細(xì)胞中也高表達(dá)多聚乳糖胺糖鏈。(9)CD147表達(dá)在胃癌細(xì)胞的胞漿和胞膜中，呈棕黃色顆粒狀，在正常胃粘膜上皮細(xì)胞中幾乎無表達(dá)。CD147在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中也高表達(dá)。(10)隨著60Co-γ射線劑量逐漸增加，West blotting檢測表明β3GnT8蛋白水平表達(dá)逐漸降低，流式細(xì)胞術(shù)進行分析表明細(xì)胞表面多聚乳糖胺糖鏈結(jié)構(gòu)表達(dá)水平逐漸降低。
　　 結(jié)論:(1)成功構(gòu)建β3GnT8及β3GnT2上調(diào)及下調(diào)細(xì)胞株。(2)β3GnT8

9、具有催化合成多聚乳糖胺糖鏈結(jié)構(gòu)的能力。(3)衣霉素對于CD147是一種非常靈敏的N-連接糖鏈合成抑制劑，可以誘導(dǎo)細(xì)胞株產(chǎn)生一條沒有糖基化的核心蛋白—CD147。(4)β3GnT8和β3GnT2可以調(diào)節(jié)HG-CD147上多聚乳糖胺糖鏈的表達(dá)，調(diào)節(jié)HG-CD147蛋白水平表達(dá)。(5)由于3’-疊氮胸腺嘧啶能夠抑制HG-CD147的合成，從而可以抑制MMP-2的表達(dá)，抑制腫瘤的生長。因此可以推論出:治療艾滋病的藥物3’-疊氮胸腺嘧啶可能具有抗