靈芝中性三萜組分的制備、質(zhì)量控制及抗腫瘤活性的研究.pdf

1、目的：優(yōu)化靈芝中性三萜組分的提取純化工藝，建立靈芝中性三萜組分的質(zhì)量控制方法，通過體內(nèi)、外實驗，評價靈芝中性三萜組分的抗腫瘤活性，并對其安全性進行初步研究，為靈芝三萜抗腫瘤新藥的研發(fā)奠定基礎。
　　方法：⑴通過單因素和正交試驗，優(yōu)化靈芝總三萜的提取工藝。⑵應用AB-8型大孔吸附樹脂，對靈芝中性三萜組分進行富集純化。⑶采用紫外-可見分光光度法（UV-vis）建立靈芝中性三萜組分中總三萜的含量測定方法。⑷運用反相高效液相色譜（RP-H

2、PLC）技術，初步建立靈芝中性三萜組分的HPLC指紋圖譜。⑸采用MTT法體外檢測兩種不同方法（溶劑法和樹脂法）制備的靈芝中性三萜組分對人慢性粒細胞白血病細胞株K562、人髓系-白血病細胞株HL60生長的抑制作用。⑹采用溶劑--熔融法，建立靈芝中性三萜固體分散體的制備方法。⑺分別建立小鼠H22和S180實體瘤以及腹水瘤的模型，觀察靈芝中性三萜組分對這兩種瘤株的抑瘤率（實體瘤）和生命延長率（腹水瘤）的影響，評價靈芝中性三萜組分體內(nèi)抗腫瘤活性

3、。⑼分別通過曠野法、金屬棒法和傾斜板法，觀察靈芝中性三萜固體分散體對小鼠自發(fā)活動及機能協(xié)調(diào)功能的影響；根據(jù)入睡率和睡眠時間來判斷靈芝中性三萜固體分散體與戊巴比妥鈉聯(lián)用對小鼠的睡眠等神經(jīng)系統(tǒng)方面的影響；使用生理機能記錄儀記錄給藥前后靈芝中性三萜固體分散體對麻醉大鼠的呼吸頻率、血壓、心率等呼吸、心血管系統(tǒng)方面的影響。
　　結果：①通過正交試驗篩選及考慮生產(chǎn)成本等因素，選定回流提取法最優(yōu)條件為：6倍量95％乙醇提取3次，每次1.5 h。

4、②使用AB-8型大孔吸附樹脂對靈芝中性三萜組分進行富集純化，以1 BV/h的流速上樣，樹脂徑高比為1：10，按照上樣液體積與樹脂體積比為4:1進行動態(tài)吸附（上樣液1 ml相當于原生藥0.35 g），水洗至無色后，依次用4倍樹脂柱體積的飽和 NaHCO3水溶液、水、60%和95%乙醇洗脫，洗脫流速為2 BV/h，收集95%乙醇洗脫液，濃縮真空干燥即得。③采用UV-vis，建立了靈芝中性三萜組分中總三萜的含量測定方法。④靈芝中性三萜組分的指

5、紋圖譜中可標定11個特征明顯的共有峰，指紋圖譜分離效果理想。⑤兩種不同方法制備的靈芝中性三萜對 K562和 HL60細胞的增殖均有抑制作用，樹脂法和溶劑法靈芝中性三萜作用于K562細胞48 h的IC50值分別是120.36μg/ml和149.36μg/ml，作用于HL60細胞48 h的IC50值分別是30.63μg/ml和24.49μg/ml。⑥采用溶劑-熔融法，以F68和44/14為載體（1:1），按藥物與載體的比例為1:8制備靈芝中

6、性三萜組分的固體分散體，從而改善三萜組分的水溶性。⑦靈芝中性三萜固體分散體的三個實驗組均有顯著抑制H22和S180實體瘤生長的作用（P<0.05），500 mg/kg組的抑瘤率分別為55.73%和53.58%；溶劑法制備的靈芝中性三萜固體分散體亦能顯著抑制 H22、S180實體瘤的生長（P<0.05），但其500 mg/kg劑量的抑瘤率分別為21.22%和31.61%；非制備成固體分散體的靈芝中性三萜CMC-Na混懸液對H22、S180

7、實體瘤的生長也有顯著的抑制作用（P<0.01），其500 mg/kg劑量的抑瘤率分別為28.28%和23.31%；靈芝中性三萜固體分散體的三個實驗組均能延長H22、S180腹水瘤小鼠的存活時間，且以中、高劑量組的生命延長率較為顯著（P<0.05），500mg/kg組的生命延長率分別為35.4%和43.4%；溶劑法靈芝中性三萜固體分散體亦能顯著延長 H22、S180腹水瘤小鼠的生存時間（P<0.05），500 mg/kg組的生命延長率分別

8、為27.1%和32.8%；中性三萜CMC-Na混懸組能延長H22腹水瘤小鼠的生存時間，但對S180腹水瘤小鼠的生存時間的延長作用更為顯著（P<0.05），500mg/kg組的生命延長率分別為15.1%和20.5%。⑧靈芝中性三萜固體分散體（250~1000 mg/kg）對小鼠的自主活動、機能協(xié)調(diào)功能、戊巴比妥鈉閾下催眠劑量及戊巴比妥鈉睡眠時間均沒有明顯的影響；對麻醉大鼠的呼吸和心血管系統(tǒng)無影響（125~500 mg/kg）。
　　

9、結論：⑴經(jīng)優(yōu)化的提取方法，穩(wěn)定可行，可用于靈芝總三萜的提取。⑵AB-8型大孔樹脂吸附洗脫法具有選擇吸附性強，富集效果理想，解吸條件較溫和等優(yōu)點，可用于靈芝中性三萜組分的富集純化。⑶采用紫外-可見分光光度法建立的靈芝中性三萜組分的含量測定方法，該方法經(jīng)典穩(wěn)定，可作為靈芝中性三萜組分質(zhì)量控制中的定量控制方法。⑷采用RP-HPLC法建立的靈芝中性三萜組分的指紋圖譜，該方法可操作性強、重復性好，可用于靈芝中性三萜組分的定性質(zhì)量控制。⑸兩種靈芝中

10、性三萜對 K562和 HL60細胞均有抑制增殖作用，表現(xiàn)出明顯的量效關系，且這兩種不同方法制備的靈芝中性三萜在體外對腫瘤細胞的抑制作用差別不大。⑹以F68和44/14為載體，采用溶劑-熔融法制備固體分散體，能提高靈芝三萜的分散性，改善靈芝三萜的水溶性，有望提高靈芝中性三萜組分的生物利用度。⑺靈芝中性三萜固體分散體對H22和S180這兩種小鼠的瘤細胞不論是實體瘤還是腹水瘤，都有較強的活性；將靈芝中性三萜組分制備成固體分散體后抗腫瘤活性增加