光合細菌Rhodobacter sphaeroldes新型異源蛋白表達體系的構建及其應用研究.pdf

1、大腸桿菌和酵母是目前最常用的表達系統,廣泛用于生產具有重要生物學功能的重組蛋白。但是,利用當前商業(yè)化的表達系統生產重組蛋白時,都不能在提取前快速、實時地檢測其表達水平。
　　 類球紅光合細菌Rhodobacter sphaeroides全基因組測序已經完成,是研究細菌光合作用和膜蛋白形成的模式生物。在合適的生長條件下,Rb.sphaeroides細胞質膜(CM)會自動內嵌形成胞質內膜系統(ICM),同時捕光色素蛋白復合體2(LH

2、2)和LH1以及光化學反應中心(RC)得到大量表達,它們的含量可超過總膜蛋白的50％。其中,IM2由9對α-亞基和β-亞基組成,分別由puc1BAC操縱子的puc1A和puc1B編碼。研究發(fā)現,該細菌中還有第二個puc操縱子puc2BA,也參與LH2的合成。LH2在～800 nm和～850 nm處有最大特征光譜吸收,LH2的表達量越高,特征光譜吸收峰值越大。因此,當異源蛋白和LH2的α-亞基或β-亞基組成融合蛋白后,便可以在提取前通過分

3、析寄主細菌培養(yǎng)液在～800 nm和～850 nm處的光譜吸收而快速實時地檢測重組蛋白的表達水平。
　　 本研究以Rb.sphaeroides DD13突變株(基因組缺失puc1BA和pufBALMX,缺少LH1、LH2和RC)為出發(fā)菌株,通過同源重組技術,敲除第二個puc操縱子puc2BA獲得了突變體Rb.sphaeroides CQU68(基因組缺失puc1BA和pufBALMX,puc2BA);利用大腸桿菌乳糖操縱子基因la

4、cIq和lacO及Rb.sphaeroides puc1BAC操縱子的啟動子pucP構建了雜合啟動子lacIq-pucP-lacO,并運用該啟動子及LH2β-亞基和α-亞基構建了適合于Rb.sphaeroides表達異源融合蛋白的表達載體pRKlacIqpucPpuc1BHis101AC;通過His-tag標簽建立了親和層析一步法快速純化LH2及LH2β-亞基融合蛋白的方法體系。利用CQU68突變體及上述表達載體表達了LH2β-亞基-G

5、FP和LH2β-亞基-HNP3融合蛋白。光譜吸收分析、SDS-PAGE和Western blotting結果表明,LH2β-亞基融合蛋白在～800 nm和～850 nm處的特征光譜吸收可以作為快速實時檢測融合蛋白表達水平的指標。
　　 本文取得的主要結論如下:
　　 1、雜合啟動子lacIq-pucP-lacO的構建實現了LH2和IM2β-亞基融合蛋白表達的人為控制,它們的表達受氧氣濃度和IPTG的嚴格調控。只有在較低的

6、氧氣濃度(半好氧)并添加IPTG誘導的情況下,LH2及LH2β-亞基融合蛋白才能表達;IPTG最佳使用濃度為1 mM。
　　 2、利用His-tag標簽通過親和層析實現了LH2及LH2β-亞基融合蛋白的一步法快速純化。純化的LH2及LH2β-亞基融合蛋白仍結合著大量的細菌葉綠素和類胡蘿卜素,具有良好的電子傳遞活性。與傳統的蔗糖密度梯度離心法相比,該方法體系大大簡化了LH2和LH2β-亞基融合蛋白的純化過程。
　　 3、利

7、用Rb.sphaeroides CQU68突變體成功表達了LH2β-亞基-GFP和LH2β-亞基-HNP3融合蛋白。融合蛋白表達后能夠伴隨著標簽蛋白LH2β-亞基進入ICM,在～800 nm和～850 nm處有LH2特異的光譜吸收。光譜吸收、SDS-PAGE和Westernblotting結果表明細菌培養(yǎng)液在～800 nm和～850 nm處的特征光譜吸收峰值越高,則LH2β-亞基融合蛋白的表達量越大。因此,在LH2β-亞基融合蛋白工程菌