深海嗜熱噬菌體GVE2裂解宿主菌的機(jī)制及GVE2感染相關(guān)代謝物的功能研究.pdf

1、眾所周知，海洋覆蓋了地球70％多的地表，蘊(yùn)育著豐富和獨(dú)特的生物資源，相比于陸生生物資源，人們對(duì)于海洋生物資源的認(rèn)識(shí)和開發(fā)還處于起步階段。自從1977年美國(guó)阿爾文號(hào)深潛器在太平洋首次發(fā)現(xiàn)了深海熱液口后，深海熱液口的生態(tài)系統(tǒng)和生物資源便受到了人們極大的關(guān)注。在深海熱液口生態(tài)系統(tǒng)中，一些化能合成細(xì)菌和古菌能夠利用地?zé)崮芎突軄?lái)合成有機(jī)物，它們是整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈的基礎(chǔ)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)在這些細(xì)菌和古細(xì)菌中存在著大量的病毒，這些病毒能夠通過裂

2、解細(xì)菌和古菌來(lái)破壞食物鏈的基礎(chǔ)從而極大地影響熱液口生態(tài)系統(tǒng)的群落結(jié)構(gòu)。同時(shí)，這些嗜熱病毒還能夠通過裂解宿主菌釋放出可溶性的有機(jī)物來(lái)參與地球化學(xué)物質(zhì)循環(huán)。因此對(duì)嗜熱病毒尤其是嗜熱菌噬菌體裂解宿主菌分子機(jī)理的研究，不僅能讓我們了解在高溫條件下病毒是如何裂解宿主菌的，而且在我們理解嗜熱病毒對(duì)深海熱液口生物群落和地球化學(xué)物質(zhì)循環(huán)的作用方面具有非常重要的意義。
　　本試驗(yàn)研究了深海熱液口高溫噬菌體GVE2裂解其宿主嗜熱細(xì)菌Geobacill

3、ussp.E263的分子機(jī)理。我們的研究發(fā)現(xiàn)，作為雙鏈DNA噬菌體，GVE2能通過編碼兩種蛋白endolysin和holin來(lái)參與宿主菌的裂解過程。endolysin蛋白是—種胞質(zhì)蛋白，具有多種肽聚糖水解酶活性，它能夠特異性地識(shí)別和降解宿主菌的細(xì)胞壁。然而endolysin蛋白自身不能跨膜運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞壁上，它需要另外—個(gè)蛋白holin的輔助。holin蛋白是噬菌體編碼的—種膜蛋白，在特定的時(shí)間和條件下，它能夠在細(xì)胞膜上聚合并形成孔洞復(fù)合物

4、，幫助endolysin蛋白從胞質(zhì)中釋放到細(xì)胞壁上。
　　為了研究holin和endolysin蛋白在裂解中的作用，首先我們研究了GVE2感染的宿主菌Geobacillus sp.E263的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明GVE2的感染能夠?qū)е滤拗骶牧呀?。接著，通過熒光顯微鏡觀察到在GVE2感染后endolysin-GFP能夠在宿主菌中聚集，表明endolysin蛋白在宿主菌裂解中發(fā)揮重要作用。隨后，我們通過Northernblot和West

5、ern blot研究GVE2感染后宿主菌內(nèi)endolysin和holin的表達(dá)量，結(jié)果表明從GVE2感染開始到宿主菌的裂解，endolysin和holin蛋白在宿主菌內(nèi)部表達(dá)。細(xì)菌雙雜交試驗(yàn)表明，宿主ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC transporter)能與噬菌體編碼的endolysin蛋白相互作用。ABC transporter蛋白是—種依賴于ATP的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，ABC transporter與endolysin蛋白的相互作用可能有助于e

6、ndolysin從細(xì)胞質(zhì)中的釋放，進(jìn)而促進(jìn)宿主菌的裂解。
　　在了解GVE2裂解宿主嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.E263的分子機(jī)理后，我們研究了細(xì)菌骨架蛋白MreB在GVE2侵染中的作用。MreB是一種在大多數(shù)桿狀細(xì)菌中都存在的骨架蛋白，它與真核生物細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白actin具有同源性，MreB在維持細(xì)菌形態(tài)以及引導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖合成過程中發(fā)揮著非常重要的作用。本試驗(yàn)通過相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，MreB的特異性抑制劑A22和

7、MP265能夠通過抑制細(xì)菌MreB的聚合來(lái)改變細(xì)菌的形態(tài)。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，MreB-GFP能夠與GVE2病毒顆粒共定位，結(jié)果揭示宿主MreB的聚合影響GVE2的侵染。
　　我們進(jìn)一步探尋從深海熱液口微生物中獲得有益生物資源的可能性。在噬菌體感染宿主菌后，宿主菌抵御噬菌體侵染可體現(xiàn)在蛋白、代謝物等分子水平。尤其是宿主菌在代謝水平上的擾動(dòng)可能會(huì)產(chǎn)生一些具有抗噬菌體活性的小分子化合物，這些活性化合物可能具有潛在的抗病毒和腫瘤的活

8、性。為此在本試驗(yàn)中，我們通過GC-MS和LC-MS方法分析了GVE2感染和未感染條件下宿主菌Geobacillus sp.E263的次生代謝產(chǎn)物變化。
　　通過分析發(fā)現(xiàn)，有27種代謝物含量發(fā)生了顯著變化，對(duì)其中3種GVE2感染后上調(diào)的代謝物色醇、對(duì)羥基苯甲醇、腺嘌呤進(jìn)行了進(jìn)一步研究。熒光定量PCR試驗(yàn)表明，色醇能夠顯著地抑制GVE2的感染和復(fù)制，而腺嘌呤能夠促進(jìn)GVE2的感染和復(fù)制。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，色醇能夠與宿主的Clp蛋白酶發(fā)生

9、相互作用。Clp蛋白酶是細(xì)菌中的一種蛋白水解酶，它能夠通過水解細(xì)菌中的蛋白底物來(lái)幫助細(xì)菌在逆境中生存。同時(shí)，還有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)Clp蛋白酶在噬菌體感染大腸桿菌的過程中發(fā)揮著重要的作用。因此，在本研究中色醇可能是通過與Clp蛋白酶的相互作用來(lái)參與宿主菌對(duì)噬菌體侵染和裂解的抵御。
　　另一方面，我們研究了GVE2感染相關(guān)代謝產(chǎn)物在抗腫瘤中的作用。研究結(jié)果表明，GVE2感染的Geobacillussp.E263代謝粗提物能夠特異性地抑制胃

10、癌細(xì)胞系A(chǔ)GS的生長(zhǎng)，而不影響胃正常上皮細(xì)胞系GES的生長(zhǎng)。通過對(duì)Geobacillus sp.E263的代謝粗提物進(jìn)行半制備型高效液相色譜分離，我們純化得到一個(gè)能特異性抑制胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS生長(zhǎng)的代謝物，氣相色譜-質(zhì)譜分析表明純化到的活性物質(zhì)可能是—種新的化合物。
　　本論文圍繞嗜熱細(xì)菌Geobacillus sp.E263與其嗜熱噬菌體GVE2在蛋白和代謝物水平上的相互作用關(guān)系展開研究。首先通過研究噬菌體編碼的endolysin

11、蛋白和宿主菌的ABC transporter蛋白的相互作用關(guān)系，闡述了在高溫條件下噬菌體裂解宿主菌的分子機(jī)制。其次，我們研究了細(xì)菌骨架MreB在GVE2侵染中的作用。
　　最后，我們探尋了從深海熱液口微生物中開發(fā)生物資源的可能性，我們通過代謝組學(xué)方法研究了Geobacillus sp.E263在GVE2感染和未感染條件下的代謝譜圖，獲得27個(gè)與GVE2感染相關(guān)的代謝物。由于噬菌體能夠通過裂解宿主菌來(lái)影響熱液口生態(tài)系統(tǒng)，因此本文的研