基于構(gòu)型轉(zhuǎn)換的核酸探針新傳感體系研究.pdf

1、核酸探針技術(shù)作為現(xiàn)代分子生物學(xué)的一種基本技術(shù)手段，與常規(guī)生物檢測(cè)方法相比，具有選擇性好、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。利用核酸探針，人們開(kāi)創(chuàng)了一系列新的檢測(cè)方法，并廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物學(xué)、食品、環(huán)境監(jiān)測(cè)和醫(yī)學(xué)診斷等各領(lǐng)域?；诤怂針?gòu)型轉(zhuǎn)換，結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)方法或光學(xué)檢測(cè)方法，本文通過(guò)設(shè)計(jì)不同類型的核酸探針，完成了以下四項(xiàng)研究工作，簡(jiǎn)述如下：
　　β-吲哚乙酸(IAA)作為一種調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的植物激素，它的許多生理效應(yīng)都與

2、其濃度密切有關(guān)。在第2章中，基于間接免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的機(jī)理，將末端標(biāo)記技術(shù)和單鏈DNA的彈性結(jié)構(gòu)結(jié)合起來(lái)，構(gòu)建了一種功能核酸探針，并通過(guò)電化學(xué)檢測(cè)手段以達(dá)到對(duì)β-吲哚乙酸的特異性檢測(cè)。該方法不僅有效回避了很多傳統(tǒng)小分子檢測(cè)方法的缺陷與不足，如高效液相色譜法或毛細(xì)管電泳法需要依賴昂貴的精密專用儀器，或樣品前處理復(fù)雜，同時(shí)結(jié)合抗體-抗原的特異性反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單、低成本、特異性檢測(cè)β-吲哚乙酸小分子的目標(biāo)。這種基于單鏈DNA彈性結(jié)構(gòu)變化的信號(hào)轉(zhuǎn)換

3、傳感技術(shù)，界面靈活，可廣泛用于其他多種基底材料中。
　　可卡因除了作為藥用麻醉藥外，其對(duì)中樞神經(jīng)有較大的毒性，反復(fù)使用，可迅速成癮，是一種非常普遍的毒品。為了緊密配合中國(guó)的禁毒需要，在第3章中，在可卡因適配體序列的基礎(chǔ)上，將5’端延長(zhǎng)，并加入了核酸切割酶的識(shí)別位點(diǎn)和標(biāo)有雙熒光基團(tuán)的分子信標(biāo)，構(gòu)建了一種基于適配體構(gòu)型轉(zhuǎn)換的分子機(jī)器熒光探針。利用適配體與可卡因靶分子結(jié)合的特異性和親和力，使長(zhǎng)鏈自身折疊并通過(guò)聚合酶的擴(kuò)增放大作用和核酸切

4、割酶的特異識(shí)別作用，實(shí)現(xiàn)了光信號(hào)的放大。采用信號(hào)/模板一體化的設(shè)計(jì)思路，有效減少了“信號(hào)損耗”。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該檢測(cè)方法選擇性好，動(dòng)力學(xué)響應(yīng)范圍為8.0×10-7M到8.0×10-2 M。
　　核酸堿基突變與人類許多遺傳疾病有關(guān)，在遺傳學(xué)、疾病的發(fā)病機(jī)理研究及早期診斷與治療等方面，單核苷酸多態(tài)性(SNP)的識(shí)別和定量分析越來(lái)越受到廣泛的重視。在第4章中，采用上述的信號(hào)/模板一體化的設(shè)計(jì)思路，結(jié)合鄰近分析手段，構(gòu)建了一種“Y型”探針

5、，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的低背景、高靈敏檢測(cè)。同時(shí)該探針具有較強(qiáng)的單堿基錯(cuò)配識(shí)別能力。當(dāng)有目標(biāo)DNA存在時(shí)，可以和輔助探針協(xié)同打開(kāi)分子信標(biāo)的發(fā)夾型結(jié)構(gòu)，三者相互雜交形成“Y型”探針。在聚合酶和核酸切割酶的共同作用下，從而實(shí)現(xiàn)了真正的目標(biāo)DNA誘發(fā)酶切循環(huán)的信號(hào)放大。與熒光標(biāo)記的直線型探針相比更加靈敏，檢測(cè)下限為10 pM。
　　G-四鏈體是端粒DNA末端富G重復(fù)序列形成的特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)，其在端粒酶催化延長(zhǎng)端粒DNA的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，

6、逐漸成為抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)腫瘤治療和的重要靶點(diǎn)。在第5章中，發(fā)現(xiàn)了一種無(wú)猝滅基團(tuán)、分子間平行G-四鏈體熒光探針的傳感體系。這種富G核酸探針可以有效猝滅熒光信號(hào)，通過(guò)將這種探針與一條無(wú)標(biāo)記的分子信標(biāo)雜交，可實(shí)現(xiàn)對(duì)其結(jié)構(gòu)和熒光信號(hào)的調(diào)控。該傳感體系具有良好的選擇性和靈敏度，對(duì)實(shí)際樣品目標(biāo)DNA的最低檢測(cè)下限可達(dá)5nM，并且能對(duì)分子信標(biāo)進(jìn)行其他方式的修飾，可用于其它目標(biāo)分子，如金屬離子、蛋白質(zhì)或非核酸配體目標(biāo)的檢測(cè)，在開(kāi)發(fā)優(yōu)良性能的分析體系方