基于核酸適體探針檢測凝血酶的研究.pdf

1、核酸適體作為一種新型的分子識別工具，與傳統(tǒng)的抗體相比不僅具有高度的親和力與特異性，還具有易合成、易修飾、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)研究中顯示出了良好的應(yīng)用潛力。近年來，結(jié)合核酸適體的分子特性，將蛋白質(zhì)的檢測轉(zhuǎn)換為特異識別的核酸適體的檢測，不僅避免了傳統(tǒng)蛋白質(zhì)檢測方法中操作復(fù)雜、常需對蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記、不易保持活性等缺點(diǎn)，還有效地提高了蛋白質(zhì)檢測的效率與靈敏度。本文以凝血酶為目標(biāo)蛋白質(zhì)，基于核酸適體( aptamer )探針技術(shù)與熒光染料、熒

2、光聚合物的光學(xué)特性，結(jié)合分子生物學(xué)中常用的工具酶，探討了核酸適體探針用于蛋白質(zhì)研究的新方法。從該思路出發(fā)，本文開展了以下三方面的研究工作： 1、基于空間位阻效應(yīng)與聚合反應(yīng)檢測凝血酶結(jié)合單鏈核酸分子在聚合酶和引物的作用下生成雙鏈DNA的特性，將核酸適體的末端進(jìn)行一定程度的堿基延伸，并設(shè)計(jì)一段與引物互補(bǔ)的序列，使得引物在聚合酶的作用下以核酸適體探針為模板進(jìn)行聚合反應(yīng)，生成雙鏈DNA產(chǎn)物，聚合反應(yīng)的進(jìn)程被熒光染料Sybr Green

3、 I實(shí)時地轉(zhuǎn)換為熒光信號。核酸適體與凝血酶特異性結(jié)合后，由于空間位阻效應(yīng)，核酸適體探針末端的聚合反應(yīng)速度受到了影響。利用熒光方法檢測聚合反應(yīng)初速度的變化，實(shí)現(xiàn)了對凝血酶簡單、快速的檢測。該方法結(jié)合聚合酶的作用與熒光染料的特性，避免了對核酸適體探針的熒光修飾，探針設(shè)計(jì)簡單靈活，對蛋白質(zhì)的檢測具有良好的特異性，檢測下限可達(dá)0.58 nmol/L。 2、基于酶切保護(hù)作用與熒光聚合物檢測凝血酶凝血酶與核酸適體探針結(jié)合后，對所結(jié)合的核酸

4、適體探針可起到一定的酶切保護(hù)的作用。在外切酶的作用下，未與凝血酶結(jié)合的核酸適體探針被水解，而與凝血酶結(jié)合的核酸適體探針則被保護(hù)而不被酶解。將凝血酶失活以后，所結(jié)合的核酸適體探針被釋放出來，與陽離子型噻吩聚合物形成二聚體結(jié)構(gòu)，將聚合物的熒光熄滅。聚合物熒光信號的變化反映了核酸適體探針?biāo)Y(jié)合凝血酶的量，從而實(shí)現(xiàn)了凝血酶的檢測。該方法將對核酸檢測具有優(yōu)勢的熒光聚合物進(jìn)一步拓展至蛋白質(zhì)的檢測中，檢測下限可達(dá)到93 pmol/L，可望發(fā)展成為一種

5、探針設(shè)計(jì)簡單靈活、成本低、通用的蛋白質(zhì)檢測方法。 3、基于接近效應(yīng)與聚合反應(yīng)檢測凝血酶利用凝血酶具有兩個核酸適體的結(jié)合位點(diǎn)，分別將兩條核酸適體設(shè)計(jì)成具有3’末端互補(bǔ)堿基序列的探針。當(dāng)兩條核酸適體探針同時結(jié)合到凝血酶的兩個結(jié)合位點(diǎn)時，探針的末端借助接近效應(yīng)形成穩(wěn)定的雜交，在聚合酶的作用下發(fā)生聚合反應(yīng)。聚合反應(yīng)的進(jìn)程被熒光染料Sybr Green I實(shí)時地轉(zhuǎn)換為熒光信號，根據(jù)檢測聚合反應(yīng)的初速度，就可實(shí)現(xiàn)對凝血酶的濃度分析。本方法