納米復(fù)合材料和酶放大構(gòu)建凝血酶電化學適體傳感器的研究.pdf

1、基于適體的電化學生物傳感器（電化學適體傳感器），因具有響應(yīng)快、靈敏度高、成本低等諸多優(yōu)點而在電化學分析領(lǐng)域備受關(guān)注。近年來，為改善其分析性能，多種具有大比表面積和優(yōu)良催化性能的納米復(fù)合材料及各種酶放大技術(shù)被相繼運用于傳感器敏感界面的設(shè)計與分析測試平臺的構(gòu)建。凝血酶(TB)作為一種生物活性蛋白，在人體抗凝、促凝的凝血級聯(lián)反應(yīng)中有著重要作用，并在生物醫(yī)學、臨床疾病診斷中有著極大的應(yīng)用價值。實現(xiàn)其簡單、靈敏的定量檢測具有十分重要的現(xiàn)實意義?；?/p>

2、于此，本文利用不同的納米復(fù)合材料并結(jié)合酶催化放大技術(shù)，構(gòu)建了三種不同的TB電化學適體傳感器，其電化學性能均有不同程度提高。這些測試體系對TB呈現(xiàn)了良好的選擇性和靈敏度，并有望在臨床中為某些疾病的診斷提供有效方法。
　　1.基于核酸外切酶誘導(dǎo)目標物循環(huán)和酶催化放大的凝血酶電化學適體傳感器
　　該體系基于核酸外切酶催化目標物循環(huán)和酶催化放大構(gòu)建了檢測TB的電化學適體傳感器。首先，將大量的乙醇脫氫酶(ADH)嵌入到具有3-D網(wǎng)狀結(jié)

3、構(gòu)的3-(巰基丙基)三甲氧基硅烷溶膠(MPTSsol)中，制備了MPTS sol-ADH生物復(fù)合物，并將其通過Au-S鍵固定到電沉積了納米金(AuNPs)的玻碳電極(GCE)表面，再電沉積一層AuNPs，形成AuNPs-MPTS sol-ADH納米復(fù)合材料。然后，固載鏈霉親和素(SA)，通過其與生物素之間的特異性結(jié)合，進一步修飾用電活性物質(zhì)亞甲基藍(MB)標記的雙鏈DNA(MB-dsDNA)。最后引入TB和核酸外切酶(RecJf)的混合

4、物。通過TB與TB適體(TBA)間的特異性結(jié)合，形成TB-TBA復(fù)合物，dsDNA發(fā)生解離，RecJf外切酶將TBA剪斷后釋放目標物TB參與后續(xù)多次循環(huán)，并在ADH與AuNPs的催化作用下，實現(xiàn)電化學信號的放大，進而提高傳感器的靈敏度。該傳感器的檢測范圍為0.5 pmol·L-1～100 nmol·L-1，檢測限為0.17pmol· L-1。
　　2.基于卟啉鐵/G-四鏈體為信號標簽及納米金-乙醇脫氫酶-石墨烯納米復(fù)合材料為納米載

5、體的凝血酶電化學適體傳感器
　　該體系以卟啉鐵/G-四鏈體為信號標簽，并以納米金-乙醇脫氫酶-石墨烯(AuNPs-ADH-GSs)納米復(fù)合物為納米載體，構(gòu)建了一個仿三酶逐級催化放大的TB電化學適體傳感器。首先，采用大比表面積的GSs作為固載平臺以實現(xiàn)大量ADH的固載。通過ADH與AuNPs間Au-N鍵，將AuNPs固載于納米復(fù)合材料ADH-GSs表面，形成AuNPs-ADH-GSs生物納米復(fù)合材料。然后，將卟啉鐵嵌入氨基標記的TB

6、適體(TBA)中形成卟啉鐵/G-四鏈體，并將其固載于AuNPs-ADH-GSs表面。最后，用牛血清白蛋白(BSA)封閉AuNPs表面剩余的活性位點，得到卟啉鐵/G-四鏈體標記的AuNPs-ADH-GSs生物納米復(fù)合物（第二適體TBAⅡ復(fù)合物）。通過“夾心型”反應(yīng)，TBAⅡ復(fù)合物被捕獲到電極表面，并產(chǎn)生相應(yīng)的電化學信號。最后，通過ADH、卟啉鐵/G-四鏈體作為辣根過氧化酶(HRP)模擬酶和NADH氧化酶的三重催化，實現(xiàn)了電化學信號的放大和

7、傳感器靈敏度的提高，其檢測限為0.3 pmol·L-1。
　　3.基于酶和多孔金@鈀核殼納米結(jié)構(gòu)協(xié)同催化放大的凝血酶電化學適體傳感器
　　該體系基于葡萄糖氧化酶(GOx)、多孔金@鈀(Au@Pd)核殼納米結(jié)構(gòu)和卟啉鐵/G-四鏈體的協(xié)同催化，構(gòu)建了信號放大型TB電化學適體傳感器。多孔Au@Pd核殼納米結(jié)構(gòu)不僅具有優(yōu)越的過氧化物酶性能，還具有大比表面積，這使其能固載大量的氨基標記的TB適體(NH2-TBA)和電活性物質(zhì)甲苯胺藍(

8、Tb)。另外，將卟啉鐵嵌入到NH2-TBA中形成具有過氧化物模擬酶特性的卟啉鐵/G-四鏈體。接著，用GOx封閉多孔Au@Pd核殼納米結(jié)構(gòu)表面剩余的活性位點，即形成TB第二適體復(fù)合物（卟啉鐵/G-四鏈體-Au@Pd-Tb-GOx生物共軛探針）。通過修飾在電極表面的NH2-TBA、目標物和第二適體復(fù)合物的“夾心型”反應(yīng)，進而得到相應(yīng)的電化學響應(yīng)信號。利用GOx、Au@Pd核殼納米結(jié)構(gòu)和卟啉鐵/G-四鏈體的協(xié)同催化，使電化學信號得到放大，靈敏