趨磁菌AMB-1超氧化物歧化酶基因的克隆表達(dá)及不同還原劑下菌體生長和磁小體合成的研究.pdf

1、趨磁菌Magnetospirillum AMB-1產(chǎn)生的磁小體是一種晶型完美、單分散性、生物性能良好的納米級(jí)Fe3O4型磁性微球，其粒徑分布在50-100nm，磁學(xué)特性與通過化學(xué)合成的磁性微球相當(dāng)。磁小體作為一種有待于開發(fā)利用的磁性納米材料，現(xiàn)已在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、電子學(xué)以及航天工業(yè)有所應(yīng)用。目前，在通過培養(yǎng)條件優(yōu)化方法來提高AMB-1生長密度及增強(qiáng)磁小體合成能力的研究中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣濃度是一個(gè)重要因素：氧氣濃度太高或太低會(huì)對(duì)菌體生長

2、及磁小體的合成產(chǎn)生明顯的抑制作用。本研究主要嘗試對(duì)AMB-1的抗氧化代謝系統(tǒng)在菌體生長、磁小體合成中的重要作用進(jìn)行初步探索研究。
　　1.AMB-1的兩個(gè)超氧化物歧化酶基因(fesod和cu/znsod)的生物信息學(xué)分析
　　對(duì)趨磁菌AMB-1的兩個(gè)超氧化物歧化酶Fe-SOD及Cu/Zn-SOD從初級(jí)結(jié)構(gòu)到空間結(jié)構(gòu)等生物信息學(xué)方面進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明：fesod基因全長597bp，編碼199個(gè)氨基酸，不含有信號(hào)肽序列，在1

3、19到137氨基酸間可能存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，其蛋白三級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)同Thermophilic CyanobacteriumThermosynechococcus Elongatus中的Fe-SOD最為相似；cu/znsod基因全長531bp，編碼177個(gè)氨基酸，可能含有信號(hào)肽序列，并且在前50個(gè)氨基酸序列可能存在2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，其蛋白三級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)同Salmonella typhimurium中的Cu/Zn-SOD最為相似。
　　2.AMB

4、-1超氧化物歧化酶基因(fesod和cu/znsod)在大腸桿菌中的克隆表達(dá)
　　在本研究中，趨磁菌AMB-1來源的fesod和cu/znsod在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行克隆表達(dá)。通過PCR的方法從AMB-1的基因組中擴(kuò)增到兩個(gè)SOD基因片段，分別連接到IPTG誘導(dǎo)型表達(dá)載體pET-20b上，得到重組質(zhì)粒pET-20b-fesod-histag和pET-20b-cu/znsod-histag，并電轉(zhuǎn)化E.coil BL21

5、(DE3)。生長曲線表明：重組菌株BL21(DE3)/(pET-20b-cu/znsod-histag)以及BL21(DE3)/(pET-20b-fesod-histag)生長速率及生長最終密度明顯高于對(duì)照組BL21(DE3)/(pET-20b)。重組菌株BL21(DE3)/(pET-20b-fesod-histagl)以及BL21(DE3)/(pET-20b-cu/znsod-histag，)單位細(xì)胞中SOD活力明顯高于對(duì)照組BL21

6、(DE3)/pET-20b)。SDS-PAGE蛋白電泳分析發(fā)現(xiàn)：fesod得到了有效表達(dá)，蛋白分子量約為22 KDa；在BL21(DE3)/(pET-20b-cu/znsod-histag)重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)中，一個(gè)推測(cè)為宿主菌中SOD蛋白(分子量約為24 KDa)的表達(dá)水平逐漸上升，而cu/znsod沒有得到表達(dá)。
　　3.通過基因工程手段提高AMB-1超氧化物歧化酶的表達(dá)水平
　　為提高趨磁菌AMB-1對(duì)氧的耐受水平，嘗

7、試通過基因工程手段增強(qiáng)該菌內(nèi)Fe-SOD和Cu/Zn-SOD兩種超氧化物歧化酶的表達(dá)水平。利用可以在革蘭氏陰性菌中復(fù)制遺傳的廣宿主載體pBBR1-MCS-4，實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了兩個(gè)游離型重組載體pBBR1-P16-fesod-histag和pBBR1-P16-cu/znsod-histag。同時(shí)，利用AMB-1基因組中的rDNA作為同源整合的目標(biāo)序列區(qū)段，實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了兩個(gè)同源重組整合型載體pET-20b-rDNA-P16-fesod-hist

8、ag和pET-20b-rDNA-P16-cu/znsod-histag。在構(gòu)建的載體中，氨芐青霉素抗性基因(ampr)作為主要的篩選標(biāo)記，AMB-1中組成型強(qiáng)啟動(dòng)子P16和來源于pET-20b的T7轉(zhuǎn)錄終止子構(gòu)成主要的表達(dá)元件。通過電轉(zhuǎn)化，游離型載體尚未能夠成功轉(zhuǎn)入AMB-1中，整合型載體也未能整合至基因組的rDNA區(qū)段。
　　4.不同濃度的還原劑對(duì)AMB-1菌體生長及磁小體合成的影響
　　為探索AMB-1生長及磁小體合成的