銅鋅超氧化物歧化酶基因的克隆及重組干酪乳桿菌的構(gòu)建.pdf

1、超氧化物歧化酶(簡稱SOD)是一種廣泛存在于動物、植物、微生物中的金屬酶，按金屬輔基的不同可分為CuZn.SOD，Mn-SOD，F(xiàn)e-SOD和Ni-SOD。銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)是一種重要的氧自由基清除劑，在體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除的動態(tài)平衡中起關(guān)鍵作用，主要催化超氧化物陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成氧和過氧化氫，因而具有防御氧毒性，增強(qiáng)機(jī)體抗輻射損傷能力，還可預(yù)防衰老，在一些疾病如腫瘤、炎癥及自身免疫疾病等的治療中有良好

2、的療效，因此研究開發(fā)CuZn-SOD倍受人們的重視。然而，目前CuZn-SOD大多是從天然動植物中提取，來源受到很大的限制，基因克隆和表達(dá)方面的研究報(bào)道相對較少。 干酪乳桿菌是公認(rèn)為安全的食品級微生物，但由于不含SOD，導(dǎo)致其對氧的耐受性較差，在有氧條件下生長較厭氧及微氧條件差，從而限制了其在工業(yè)中的應(yīng)用。若以干酪乳桿菌作為表達(dá)CuZn-SOD基因的受體菌株，可以集乳酸菌的益生功能和CuZn-SOD蛋白的生物學(xué)特性于一體，有望開

3、發(fā)出新一代功能性食品及微生態(tài)制劑，干酪乳桿菌工程菌本身及其表達(dá)產(chǎn)物可直接應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)和保健業(yè)等領(lǐng)域，有著巨大的應(yīng)用前景和潛在的商業(yè)價值。 本研究利用基因工程方法，構(gòu)建大腸桿菌CuZn-SOD目的基因的表達(dá)重組子，將其電轉(zhuǎn)化至干酪乳桿菌，并對重組菌進(jìn)行初步檢測鑒定，為進(jìn)一步研究CuZn-SOD的表達(dá)對干酪乳桿菌生物學(xué)特性的影響、開發(fā)可直接食用型SOD產(chǎn)品或微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容主要分為兩個部分： ①E.c

4、oli CuZn-SOD基因的克?。焊鶕?jù)GenBank中發(fā)表的sodC基因序列，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成了一對引物P1(5'-GTG GAGCTCACGGAGGTCCTATGAAACG-3')、P2(5'-CAG GGTACCTACAGCGGATTTTGGGGACA-3')；通過優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件，從E coli MGl655的基因組DNA中擴(kuò)增出長685bp的sodC基因片段；通過T4 DNA連接酶將其連

5、接到克隆載體pMD18-T中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pT-sodC，再將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中；然后提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切、PCR鑒定和序列測定。結(jié)果表明成功地克隆了E.coli CuZn-SOD基因片段。 ②E.coli CuZn-SOD基因重組干酪乳桿菌的構(gòu)建：利用軟件設(shè)計(jì)并合成了一對引物PF(5'-CTGTCTAGA ATGAAACGTITFAGTCTGGC-3')、PR(5'-CGCAAGCTT CTTATTACACCACAGGC

6、A-3')；以pT-sodC為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMDl8-T中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-sodC；雙酶切后將sodC基因的全編碼序列克隆至pMG36e的Xba I和Hind Ⅲ之間的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建表達(dá)重組子pMG36e-sodC；然后通過優(yōu)化的電轉(zhuǎn)化條件(電壓2.5kV，電阻100Ω，電容25uF)，將pMG36e-sodC轉(zhuǎn)化至干酪乳桿菌Lb.casei，并對重組菌株進(jìn)行質(zhì)粒抽提、PCR鑒定、酶切鑒定。結(jié)果表